※ 引述《sswweett (lalala)》之銘言： : 想請教各位大大關於cloning的問題 : 我的insert是primer有設計RE的PCR product(1.2K) : (用的是zero Blunt TOPO PCR cloning kit) 不懂？zero blunt TOPO是幫助你五分鐘內接成blunt end PCR product.... 你設計primer有RE何意？因為vector上有SalI/PstI sites嗎？ 怎不用pfu作PCR直接用zero blunt TOPO vector接？ : vector 是5K pCR-BluntII TOPO vector是3.5k吧？而且沒有salI site啊? : 用2種RE分別切(SalI/PstI)insert 和 vector(O/N), : 切完之後跑膠,進行gel extraction : 以elution buffer回溶 : 接著進行ligation(> O/N 16度) : Insert : Vector 莫耳數比試過 3:1 和 5:1 : DNA total 濃度試過 56 和 222 ng : (用的是Takara T4 DNA ligase,也換過其他家廠牌) : 最後進行transformation TOPO比T4 ligase強很多 : (用的是HIT compentent cell,也用過益生的 compentent cell) : 我所選用的抗生素是chloramphenicol(試過20和30 μg/ml) pCR-BluntII TOPO vector不是kan? : 最後一顆菌也沒長 > < : 我在想會不會是因為vector上2個切點太近的關係(就在隔壁) : 所以事實上只切了一刀 : 不過因為這個vector是從別的實驗室取得的 而他們切都成功 : 似乎駁回我這個想法 : 不知道板上的大大有沒有什麼建議提供給我 : 已經過了2個月了 都一直沒有成功 > < --

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