※ 引述《sswweett (lalala)》之铭言： : 想请教各位大大关於cloning的问题 : 我的insert是primer有设计RE的PCR product(1.2K) : (用的是zero Blunt TOPO PCR cloning kit) 不懂？zero blunt TOPO是帮助你五分钟内接成blunt end PCR product.... 你设计primer有RE何意？因为vector上有SalI/PstI sites吗？ 怎不用pfu作PCR直接用zero blunt TOPO vector接？ : vector 是5K pCR-BluntII TOPO vector是3.5k吧？而且没有salI site啊? : 用2种RE分别切(SalI/PstI)insert 和 vector(O/N), : 切完之後跑胶,进行gel extraction : 以elution buffer回溶 : 接着进行ligation(> O/N 16度) : Insert : Vector 莫耳数比试过 3:1 和 5:1 : DNA total 浓度试过 56 和 222 ng : (用的是Takara T4 DNA ligase,也换过其他家厂牌) : 最後进行transformation TOPO比T4 ligase强很多 : (用的是HIT compentent cell,也用过益生的 compentent cell) : 我所选用的抗生素是chloramphenicol(试过20和30 μg/ml) pCR-BluntII TOPO vector不是kan? : 最後一颗菌也没长 > < : 我在想会不会是因为vector上2个切点太近的关系(就在隔壁) : 所以事实上只切了一刀 : 不过因为这个vector是从别的实验室取得的 而他们切都成功 : 似乎驳回我这个想法 : 不知道板上的大大有没有什麽建议提供给我 : 已经过了2个月了 都一直没有成功 > < --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 210.58.54.177