作者sMallhaOnPtt (忘了該怎麼休息。)
看板Biotech
標題[求救] 有關蛋白degrade
時間Thu Jan 24 21:50:04 2008
小弟最近在做一個蛋白
我做的蛋白有接GST 是用 pGEX-4T-1 vector 表現
用的菌是BL21(DE3)
經過純化的結果 我發現我這個蛋白degrade超嚴重
至少有50% 以上 可能到70~80% 都degrade掉了
本來在37度養到O.D 600 > 1.0， 在25度 induction，IPTG濃度 1mM
後來我有做不同induction的時間 其實和一般protocol差不多
在三小時後就會有蛋白表現 只是 它瘋狂degrade
現在是在25度養 18度induction 這樣做似乎沒有改善太多
所以想請教各位大大
有沒有人做過蛋白也會degrade的 是怎麼解決的
我目前能想到的就是應該換其它的strain 來表現？
有人知道有什麼strain可以表現這種難搞的蛋白嗎？
或是 再改溫度、IPTG濃度？
還是遇到這種情形只能硬做？ @@"
我只是想參考下有經驗的人 解決的方法
謝謝各位了~~~~~
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◆ From: 123.192.246.24
1F：推 sGoat:請教一下蛋白純化的步驟,可能是這裡導致蛋白降解嚴重... 01/24 22:35
2F：→ sMallhaOnPtt:基本上破菌完就很明顯可公看到degrade那幾條band了 01/24 22:50
3F：→ sMallhaOnPtt:我有加protease inhibitor 01/24 22:51
4F：→ sMallhaOnPtt:和一般GST純化的protocol差不多，破菌完和beads先 01/24 22:53
5F：→ sMallhaOnPtt:binding 之後用PBS wash之後用10mM Glutathione, 50 01/24 22:53
6F：→ sMallhaOnPtt:mM Tris-Cl, pH 8.0 去elute 01/24 22:54
7F：→ sMallhaOnPtt:全程都在cool room 01/24 22:56
8F：推 sGoat:有試過提高inhibitor的濃度嗎,或是換個inhibitor? 01/24 23:33
9F：推 konlon:Try to use His-tag for protein purification !! 01/25 00:28
10F：→ sMallhaOnPtt:嗯... 我是利用細菌來進行sumoylation 在sumo上有接 01/25 00:34
11F：→ sMallhaOnPtt:His-tag 01/25 00:35
12F：→ sMallhaOnPtt:也就是說我的E.coli裡有二個plasmid 01/25 00:36
13F：→ sMallhaOnPtt:所以 可能換其它的tag試試看嗎？ 不要用GST嗎？ 01/25 00:37
14F：→ sMallhaOnPtt:所以蛋白degrade成這樣 是GST-tag 的關係？ 01/25 00:39
15F：推 simonmiho:我當時有做過GST接一個membrane protease蛋白..也是會 01/25 00:51
16F：→ simonmiho:生些許的degrade..所以有部份是蛋白的本身特性.. 01/25 00:52
17F：→ simonmiho:如果沒有inclusion body 或產量的問題...His 是一個 01/25 00:54
18F：→ simonmiho:比較好的選擇..另外也有可能是GST跟protein之間的link 01/25 00:56
19F：→ simonmiho:的sequence剛好不太適合你.. 01/25 00:58
20F：→ simonmiho:好像一般GST是接N端..如果沒辦法的話接C端呢? 01/25 00:59
21F：推 milkpa:如果換成protease free的Host呢？ 01/25 12:24
22F：推 ralphlee:和樓上學長的意見一樣 換一個菌種看看~~~ 01/26 10:00