作者sMallhaOnPtt (忘了该怎麽休息。)
看板Biotech
标题[求救] 有关蛋白degrade
时间Thu Jan 24 21:50:04 2008
小弟最近在做一个蛋白
我做的蛋白有接GST 是用 pGEX-4T-1 vector 表现
用的菌是BL21(DE3)
经过纯化的结果 我发现我这个蛋白degrade超严重
至少有50% 以上 可能到70~80% 都degrade掉了
本来在37度养到O.D 600 > 1.0， 在25度 induction，IPTG浓度 1mM
後来我有做不同induction的时间 其实和一般protocol差不多
在三小时後就会有蛋白表现 只是 它疯狂degrade
现在是在25度养 18度induction 这样做似乎没有改善太多
所以想请教各位大大
有没有人做过蛋白也会degrade的 是怎麽解决的
我目前能想到的就是应该换其它的strain 来表现？
有人知道有什麽strain可以表现这种难搞的蛋白吗？
或是 再改温度、IPTG浓度？
还是遇到这种情形只能硬做？ @@"
我只是想参考下有经验的人 解决的方法
谢谢各位了~~~~~
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1F：推 sGoat:请教一下蛋白纯化的步骤,可能是这里导致蛋白降解严重... 01/24 22:35
2F：→ sMallhaOnPtt:基本上破菌完就很明显可公看到degrade那几条band了 01/24 22:50
3F：→ sMallhaOnPtt:我有加protease inhibitor 01/24 22:51
4F：→ sMallhaOnPtt:和一般GST纯化的protocol差不多，破菌完和beads先 01/24 22:53
5F：→ sMallhaOnPtt:binding 之後用PBS wash之後用10mM Glutathione, 50 01/24 22:53
6F：→ sMallhaOnPtt:mM Tris-Cl, pH 8.0 去elute 01/24 22:54
7F：→ sMallhaOnPtt:全程都在cool room 01/24 22:56
8F：推 sGoat:有试过提高inhibitor的浓度吗,或是换个inhibitor? 01/24 23:33
9F：推 konlon:Try to use His-tag for protein purification !! 01/25 00:28
10F：→ sMallhaOnPtt:嗯... 我是利用细菌来进行sumoylation 在sumo上有接 01/25 00:34
11F：→ sMallhaOnPtt:His-tag 01/25 00:35
12F：→ sMallhaOnPtt:也就是说我的E.coli里有二个plasmid 01/25 00:36
13F：→ sMallhaOnPtt:所以 可能换其它的tag试试看吗？ 不要用GST吗？ 01/25 00:37
14F：→ sMallhaOnPtt:所以蛋白degrade成这样 是GST-tag 的关系？ 01/25 00:39
15F：推 simonmiho:我当时有做过GST接一个membrane protease蛋白..也是会 01/25 00:51
16F：→ simonmiho:生些许的degrade..所以有部份是蛋白的本身特性.. 01/25 00:52
17F：→ simonmiho:如果没有inclusion body 或产量的问题...His 是一个 01/25 00:54
18F：→ simonmiho:比较好的选择..另外也有可能是GST跟protein之间的link 01/25 00:56
19F：→ simonmiho:的sequence刚好不太适合你.. 01/25 00:58
20F：→ simonmiho:好像一般GST是接N端..如果没办法的话接C端呢? 01/25 00:59
21F：推 milkpa:如果换成protease free的Host呢？ 01/25 12:24
22F：推 ralphlee:和楼上学长的意见一样 换一个菌种看看~~~ 01/26 10:00