作者Nikio (工作有夠忙)
看板Biotech
標題[求救] Western怪怪說
時間Fri Jan 25 19:35:06 2008
想請教大家一些問題 ><
今天壓western很怪，五分鐘、十分鐘 都一片空白，就狠下心給他壓了3小時，
結果整片MEMBRANE都黑了，但跑出了一堆一條條白色的bands，好像位置又是我要的
protein @@ 見鬼，怎麼變成白色的呢？ 對了 連marker也變成白色的
和同學討論結果可能是：二抗太強，把ECL在壓片前就吃光光，可以解釋為何第一次壓
沒壓出來但長時間壓卻變白色的（被HRP吃掉以致於正確位置的protein無法顯色）
不過好怪喔～如果說是我要target的protein還解釋的通，為何pre-stain也變白的@@?
另外想請教大家：
如果壓不好，壓不出東西，或挑錯壓片的時間點，再加ECL去壓還壓的出來嗎？
很懷疑在membrane上的HRP是不是真的還能用？
因為我之前做ELISA有種經驗，就是不小心錯過顯色時間，沒測到linear OD的範圍，
想說：好吧！反正enzyme還是在盤子上，應該還有用，結果加下去就不呈色了！不然就是
呈色的時間拉長，或是沒辦法變的跟第一次加的時候一樣強..大家有這種經驗嗎？
小好奇～就是像這些顯色的enzyme，是不是作用後之後就失效，或是大幅降低酵素能
力了呢？
感恩 ><
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 211.76.175.170
1F：推 naturer:曝光過度 01/25 19:52
2F：推 a64toto:時效過完加再多也沒用喔 01/25 22:06
3F：→ a64toto:可以把ECL跟抗體洗掉重新來一次 01/25 22:06
5F：推 changyaowen:白band通常是太強造成反白 不過壓久才出現 需要擔心是 01/25 23:00
6F：→ changyaowen:是非專一性出現的band 不然應該一開始就壓得出來 01/25 23:01
7F：→ changyaowen:專一性的band應該只會出現一條 短時間>黑 長時間>白 01/25 23:03
8F：推 ralphlee:壓片時間太久了 以秒為單位試試看 用個10秒20秒~~ 01/26 10:08