講一下我的經驗好了 之前做過就有在做primer design的工作 最近也正好再接觸Real time PCR 的部分 一般的primer design注意兩件事情 1.序列盡量保持亂數，ATCG通通都成亂數排列 2.CG%要控制好，盡量CG:AT=1:1 當然如果是clone等狀況就另當別論.......... 而在 Realtime 部分 我目前用的是ABI的機器 SYBR Green的系統 primer design的部分我交給primer expression去設計 在我所選定的特定範圍中做（等等詳述） 只要是用ABI的機器，理論上都有『primer expressoin』這套軟體可用 如果是Roche 的話我就不熟了....... 以下是軟體的部分設定值 Tm值設在58~60℃(原廠設定) product size 50-150 bp(原廠設定) 之前問廠商最多可以到250bp CG% 30%-80%(原廠設定) 不過考慮二級結構和Tm等問題我設定在30%-50%最多60% primer length 個人習慣設定在 20bp上下...不超過30bp primer 3' GC不要超過2 bp (原廠設定) 最好也都不要有CG G repeats 不要超過3 bp Probe部分不寫.... 另外SYBR Green部分要特別注意Dimer 的問題 所以一對primer設計出來後要特別去注意一下 對本身和對另一條primer有無dimer的產生... 最後........ 序列選擇上...只要是許可狀況下 我都會選擇有跨過junation的部分來設計 這樣可以避免gemone DNA 的干擾...... 以上...大概是這樣 ※ 引述《phine (this is me)》之銘言： : 大家好呦 : 最近想要找幾種基因跑 Q-PCR : 打算從NCBI找SEQUENCE : 用PRIMER 3 來設計 : 請問一下在用PRIMER 3 設計的時候 : 大家會考慮到什麼參數呢 : 我目前只有對Tm 和PRODUCT SIZE有所限制 : （我是用syber green系統） : 另外 : 為配合其他基因一起跑 : 目前同一盤設定的溫度為 : annealing temp 60度 : elogation temp 72度 : 請問這樣大家會建議 : PRIMER的Tm多少比較好跑呢 : 最後一個問題就是 : 我之前請明欣合成PRIMER : 他合出來的Tm跟我當初設計的差很多 : （低了二十度 70變50） : 我反應後 : 他的理由是每種程式計算TM的方法有差 : 但是會差到那麼多嗎？？ : 這樣我的 annealing temp也不知道從哪裡測試了 ︿︿； : 有人有碰到跟我一樣的問題嗎 : 挖真是有點落落長 : 感謝大家的耐心歐 : 希望大家新年快樂呦 -- 夜生活不只是一種生活，更是一種態度，音樂有很多類型，夜店有很多種類 喜歡與否只是一種偏好，卻不代表全部的選擇，夜生活的多樣與多變應該是 讓人有更多更廣的眼光看生活與體驗......... --

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