讲一下我的经验好了 之前做过就有在做primer design的工作 最近也正好再接触Real time PCR 的部分 一般的primer design注意两件事情 1.序列尽量保持乱数，ATCG通通都成乱数排列 2.CG%要控制好，尽量CG:AT=1:1 当然如果是clone等状况就另当别论.......... 而在 Realtime 部分 我目前用的是ABI的机器 SYBR Green的系统 primer design的部分我交给primer expression去设计 在我所选定的特定范围中做（等等详述） 只要是用ABI的机器，理论上都有『primer expressoin』这套软体可用 如果是Roche 的话我就不熟了....... 以下是软体的部分设定值 Tm值设在58~60℃(原厂设定) product size 50-150 bp(原厂设定) 之前问厂商最多可以到250bp CG% 30%-80%(原厂设定) 不过考虑二级结构和Tm等问题我设定在30%-50%最多60% primer length 个人习惯设定在 20bp上下...不超过30bp primer 3' GC不要超过2 bp (原厂设定) 最好也都不要有CG G repeats 不要超过3 bp Probe部分不写.... 另外SYBR Green部分要特别注意Dimer 的问题 所以一对primer设计出来後要特别去注意一下 对本身和对另一条primer有无dimer的产生... 最後........ 序列选择上...只要是许可状况下 我都会选择有跨过junation的部分来设计 这样可以避免gemone DNA 的干扰...... 以上...大概是这样 ※ 引述《phine (this is me)》之铭言： : 大家好呦 : 最近想要找几种基因跑 Q-PCR : 打算从NCBI找SEQUENCE : 用PRIMER 3 来设计 : 请问一下在用PRIMER 3 设计的时候 : 大家会考虑到什麽参数呢 : 我目前只有对Tm 和PRODUCT SIZE有所限制 : （我是用syber green系统） : 另外 : 为配合其他基因一起跑 : 目前同一盘设定的温度为 : annealing temp 60度 : elogation temp 72度 : 请问这样大家会建议 : PRIMER的Tm多少比较好跑呢 : 最後一个问题就是 : 我之前请明欣合成PRIMER : 他合出来的Tm跟我当初设计的差很多 : （低了二十度 70变50） : 我反应後 : 他的理由是每种程式计算TM的方法有差 : 但是会差到那麽多吗？？ : 这样我的 annealing temp也不知道从哪里测试了 ︿︿； : 有人有碰到跟我一样的问题吗 : 挖真是有点落落长 : 感谢大家的耐心欧 : 希望大家新年快乐呦 -- 夜生活不只是一种生活，更是一种态度，音乐有很多类型，夜店有很多种类 喜欢与否只是一种偏好，却不代表全部的选择，夜生活的多样与多变应该是 让人有更多更广的眼光看生活与体验......... --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 123.192.165.194