作者leftt (left)
看板Biotech
標題Re: [求救] real-time pcr的問題
時間Tue Feb 19 12:28:51 2008
原PO的問題應該是不懂realtimePCR
而且是整個公司都不太懂
然後ROCHE的專員跟版眾一樣 秀才遇到兵 呵呵
如果搞不懂 換AB, BioRad的realtime機器也是一樣
八連排的tube 出來的data也不會比較漂亮唷
而且AB的試劑也沒有便宜到哪裡去吧
幾個重點
1.realtimePCR本來就可以做診斷
就我所知疾管局就有用 當年診斷SARS時也很風光
你可以帶隊殺去學的地方其實還不少
問題是 一般人都只願意帶學習態度誠懇的人做實驗吧
2.RT-PCR跑膠有band所以你認為診斷正確 不需要sequence就可以
但是你怎麼知道你哪個band是正確的放大標的物?
也許是數個尺寸一樣但是內容不同的放大產物混合在一起勒
realtimePCR可以利用melting curve偵測是否為單一純產物
3.毛細管的產物也可以抽出來跑電泳
如果你們實驗設計是正確的 那這個電泳產物和RT-PCR的產物應該是要一致的
普通PCR的primer也可以試跑realtimePCR的
有時候你可以發現原來先前跑普通PCR的primer是大大的有問題
可能是產物不對 也可能有嚴重的primer dimer
4.過了melting curve後整個螢光值掉下來
請先了解melting curve的定義以及用途
還有螢光染劑發光的原理及時機
5.分子生物學實驗本來就要求較純的原料
因為在放大檢測的狀況 一點細微的誤差很容易就被無限放大而蓋住原有資料
普通 PCR也無法忍受亂七八糟的檢體吧 只是他出錯的時候比較不容易被發現
相對而言 data也比較不可信賴
如果目標真的不好偵測 也許不要用SyBr 換TaqMan probe看看
正確率也許高一點
6.realtimePCR的確為快速診斷的工具
如果你了解早期診斷的工具就知道 有些病毒培養確認動輒是兩週三週的時間
跑realtimePCR可以縮短到數小時即有結果
而ROCHE毛細管PCR由於是空氣加熱 升降溫快速 cycle time較一般機器短
說快速也沒錯
你們的問題是出在對實驗原理不了解
其實只要找一個學分生的 有在作realtimePCR的
花個幾天時間大概就可以找出毛病在哪裡
對於會用的人
LightCycler其實挺好用的 介面也比較親切
可是對於不懂也不願意去學的人
那只是一台一百多萬的小電鍋而已 而且還會狂吃耗材錢唷
※ 引述《micocat (de novo)》之銘言：
: : 前文已說 做RT-PCR做的出來 做REAL-TIME PCR 就算很純 也未必出的來
: RT-PCR 跟real-time pcr的要求是不一樣的
: 我們實驗室有遇過同樣的primer RT做的出來，real-time卻p不到的情形
: 後來換了primer就解決了
: 建議可以換組primer試試
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 211.77.241.3
1F：推 latte366:精闢!! 02/19 13:24
2F：推 freesoul:大推這篇! 我覺得原po最大的問題在心態 02/19 15:06
3F：→ freesoul:我很少看到這種把義務役當兵的心態帶進職場的 02/19 15:07
4F：推 oopa:很有幫助的文章!謝謝分享^^ (不過可能沒人幫得了原po=.=) 02/19 15:21
5F：推 Jaden:感謝您的心得分享...希望原po能看到這篇 02/20 02:06
6F：推 turtle24:太精闢了..不過我覺得原po會看不懂 02/20 10:54
7F：推 amon7279:我在非洲做HIV病毒定量也用real time 超好用的 02/20 17:51
8F：→ amon7279:不過一般公司實驗系統還沒建立起來就買儀器 很大方耶 02/20 17:52
9F：→ forWinds:^^ 02/20 20:21
10F：推 AS1:不是沒建立起來 是想要更快速 才買他 02/21 18:48
11F：推 qqo8855436:人類大概真的沒有辦法和外星人溝通... 02/21 20:25
12F：推 AS1:所以樓上你也是外星人 不然你在跟誰溝通 02/21 20:44
13F：→ AS1:公司五千人 或許有人懂 我們這課只有八人 02/21 20:44