作者leftt (left)
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标题Re: [求救] real-time pcr的问题
时间Tue Feb 19 12:28:51 2008
原PO的问题应该是不懂realtimePCR
而且是整个公司都不太懂
然後ROCHE的专员跟版众一样 秀才遇到兵 呵呵
如果搞不懂 换AB, BioRad的realtime机器也是一样
八连排的tube 出来的data也不会比较漂亮唷
而且AB的试剂也没有便宜到哪里去吧
几个重点
1.realtimePCR本来就可以做诊断
就我所知疾管局就有用 当年诊断SARS时也很风光
你可以带队杀去学的地方其实还不少
问题是 一般人都只愿意带学习态度诚恳的人做实验吧
2.RT-PCR跑胶有band所以你认为诊断正确 不需要sequence就可以
但是你怎麽知道你哪个band是正确的放大标的物?
也许是数个尺寸一样但是内容不同的放大产物混合在一起勒
realtimePCR可以利用melting curve侦测是否为单一纯产物
3.毛细管的产物也可以抽出来跑电泳
如果你们实验设计是正确的 那这个电泳产物和RT-PCR的产物应该是要一致的
普通PCR的primer也可以试跑realtimePCR的
有时候你可以发现原来先前跑普通PCR的primer是大大的有问题
可能是产物不对 也可能有严重的primer dimer
4.过了melting curve後整个萤光值掉下来
请先了解melting curve的定义以及用途
还有萤光染剂发光的原理及时机
5.分子生物学实验本来就要求较纯的原料
因为在放大检测的状况 一点细微的误差很容易就被无限放大而盖住原有资料
普通 PCR也无法忍受乱七八糟的检体吧 只是他出错的时候比较不容易被发现
相对而言 data也比较不可信赖
如果目标真的不好侦测 也许不要用SyBr 换TaqMan probe看看
正确率也许高一点
6.realtimePCR的确为快速诊断的工具
如果你了解早期诊断的工具就知道 有些病毒培养确认动辄是两周三周的时间
跑realtimePCR可以缩短到数小时即有结果
而ROCHE毛细管PCR由於是空气加热 升降温快速 cycle time较一般机器短
说快速也没错
你们的问题是出在对实验原理不了解
其实只要找一个学分生的 有在作realtimePCR的
花个几天时间大概就可以找出毛病在哪里
对於会用的人
LightCycler其实挺好用的 介面也比较亲切
可是对於不懂也不愿意去学的人
那只是一台一百多万的小电锅而已 而且还会狂吃耗材钱唷
※ 引述《micocat (de novo)》之铭言：
: : 前文已说 做RT-PCR做的出来 做REAL-TIME PCR 就算很纯 也未必出的来
: RT-PCR 跟real-time pcr的要求是不一样的
: 我们实验室有遇过同样的primer RT做的出来，real-time却p不到的情形
: 後来换了primer就解决了
: 建议可以换组primer试试
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 211.77.241.3
1F：推 latte366:精辟!! 02/19 13:24
2F：推 freesoul:大推这篇! 我觉得原po最大的问题在心态 02/19 15:06
3F：→ freesoul:我很少看到这种把义务役当兵的心态带进职场的 02/19 15:07
4F：推 oopa:很有帮助的文章!谢谢分享^^ (不过可能没人帮得了原po=.=) 02/19 15:21
5F：推 Jaden:感谢您的心得分享...希望原po能看到这篇 02/20 02:06
6F：推 turtle24:太精辟了..不过我觉得原po会看不懂 02/20 10:54
7F：推 amon7279:我在非洲做HIV病毒定量也用real time 超好用的 02/20 17:51
8F：→ amon7279:不过一般公司实验系统还没建立起来就买仪器 很大方耶 02/20 17:52
9F：→ forWinds:^^ 02/20 20:21
10F：推 AS1:不是没建立起来 是想要更快速 才买他 02/21 18:48
11F：推 qqo8855436:人类大概真的没有办法和外星人沟通... 02/21 20:25
12F：推 AS1:所以楼上你也是外星人 不然你在跟谁沟通 02/21 20:44
13F：→ AS1:公司五千人 或许有人懂 我们这课只有八人 02/21 20:44