作者latte366 ( )
看板Biotech
標題Re: [求救] Western怪怪說
時間Wed Feb 20 21:48:59 2008
※ 引述《Nikio (工作有夠忙)》之銘言：
想請教大家一些問題 ><
今天壓western很怪，五分鐘、十分鐘 都一片空白，就狠下心給他壓了3小時，
結果整片MEMBRANE都黑了，但跑出了一堆一條條白色的bands，好像位置又是我要的
protein @@ 見鬼，怎麼變成白色的呢？ 對了 連marker也變成白色的
和同學討論結果可能是：二抗太強，把ECL在壓片前就吃光光，可以解釋為何第一次壓
沒壓出來但長時間壓卻變白色的（被HRP吃掉以致於正確位置的protein無法顯色）
不過好怪喔～如果說是我要target的protein還解釋的通，為何pre-stain也變白的@@?
=========我===========是===========分==========隔===========線===============
吃掉一部份 ^^""
借這個標題想請教一下最近western 的壓片問題 (順便PO個圖好讓別人當錯誤參考)
以下連結是壓片的結果
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=latte0619&b=5&f=1306670456&p=0
問題一:
請問照片中白白一條一條的原因是因為過曝嗎?
方法:
壓片15min， loading:120ug total protein
一抗用1:500稀釋，overnight(16hr)，
(學長是說我一抗加太多了 同學則是說我壓太久)
二抗用1:5000稀釋，1hr
一抗二抗皆是以5%脫脂奶粉泡在TBS
且wash過程皆是TBST 10min 5次，shaking
transfer: 340mA，1hr，用semi-dry的方式
Blocking: 5%脫脂奶粉泡在TBS，1hr
至於為什麼會loading這麼多protin 因為要看的是membrane上的蛋白
怕她量太少 所以才loading這麼多 (是不是太多了點...orz)
問題二:
加入sample buffer後 煮5min 置於室溫 (有另一說法要置於冰上 請問各位怎麼做)
以上兩個問題
希望有這方面經驗的前輩能給個建議
感恩 ^^
圖片歡迎轉載 大家一起討論長知識
=========我===========是===========分==========隔===========線===============
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 211.76.175.170
1F：推 naturer:曝光過度 01/25 19:52
2F：推 a64toto:時效過完加再多也沒用喔 01/25 22:06
3F：→ a64toto:可以把ECL跟抗體洗掉重新來一次 01/25 22:06
5F：推 changyaowen:白band通常是太強造成反白 不過壓久才出現 需要擔心是 01/25 23:00
6F：→ changyaowen:是非專一性出現的band 不然應該一開始就壓得出來 01/25 23:01
7F：→ changyaowen:專一性的band應該只會出現一條 短時間>黑 長時間>白 01/25 23:03
8F：推 ralphlee:壓片時間太久了 以秒為單位試試看 用個10秒20秒~~ 01/26 10:08
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◆ From: 140.116.93.52
※ 編輯: latte366 來自: 140.116.93.52 (02/20 21:53)
9F：推 bluecsky:靠..1抗1:500就算了..還O/N..你1抗是怎麼來的?純度不好? 02/20 22:13
10F：→ bluecsky:2抗1:5000也有點多..買來的antibody 1抗1:3000 or 1:5000 02/20 22:14
11F：→ bluecsky:2抗1:10000甚至1:20000都可以.. 02/20 22:14
12F：→ bluecsky:而且protein還load滿多量的..你這樣的量 02/20 22:15
13F：→ bluecsky:說不定光是壓個10秒band都超黑的..= = 02/20 22:15
14F：→ bluecsky:1抗不用到O/N啦..跟二抗一樣1小時就好 02/20 22:16
15F：→ latte366:哈 其實我也覺得太多 這是有原因的 以下說明 02/20 22:18
16F：→ bluecsky:不過你壓5min沒東西.. 02/20 22:19
17F：→ latte366:一開始用santacruze的抗體 loading 40ug protein跑不出來 02/20 22:19
18F：→ bluecsky:看錯..5min沒東西不是你的問題 02/20 22:20
19F：→ latte366:後來改loading 120ug 就有 可惜雜band太多 02/20 22:20
20F：→ latte366:改ABcam的monlonal clonal Ab後 其實也想過titer 02/20 22:20
21F：→ bluecsky:雜band多..你是抗什麼的?專一性不高摟 02/20 22:21
22F：→ latte366:要不要重測 或許不需要那麼濃 蛋白質也不用loading那麼多 02/20 22:21
23F：→ bluecsky:雜band多可能跟你1抗過多還有時間過久有關吧 02/20 22:22
24F：推 tsubasawolfy:唔 不是有針對膜蛋白的萃取方式? 02/20 22:22
25F：→ bluecsky:protein 40ug做不出可以提升一下量..或許真的很少很少 02/20 22:22
26F：→ latte366:只是因為一些因素 後來還是照原來condition跑 02/20 22:23
27F：→ latte366:b大可以請問您 那一條條白白的是因為一抗太濃嗎？ 02/20 22:24
28F：推 bluecsky:我覺得你降低antibody量應該可以提升專一性 02/20 22:24
29F：→ bluecsky:白白的應該是太亮..曝光過久 02/20 22:25
30F：→ bluecsky:就你的圖看來真的抓很多莫名其妙的東西的感覺 02/20 22:26
31F：→ bluecsky:你壓片壓多久? 02/20 22:26
32F：→ latte366:t大 膜蛋白的翠取方式 其實我最近還在看資料 02/20 22:26
33F：→ latte366:之前沒做過 所以不敢做 現在的方法是用前人的 02/20 22:26
34F：→ latte366:感謝您b大 我下次試著把一抗二抗降低titer 02/20 22:27
35F：→ latte366:30min 不過 另一個同學 同一支Ab 一抗、二抗1:2000 02/20 22:28
36F：→ latte366:出來的結果就很漂亮 沒有我的問題 02/20 22:29
37F：推 bluecsky:壓片時間也影響很大..除非量很少要不然基本上壓幾秒 02/20 22:30
38F：→ bluecsky:頂多到幾分鐘應該結果都不錯 02/20 22:30
39F：→ latte366:打錯 是15min 02/20 22:30
40F：→ bluecsky:要不要試試壓30秒之類的短時間..說不定就可以了 02/20 22:31
41F：→ latte366:那我懂了 明天再來試試 謝謝兩位 ^^ 02/20 22:31
42F：→ latte366:恩恩 OK 我下次試看看 謝謝您 02/20 22:32
43F：推 tsubasawolfy:壓超過15min的我就會放棄重做.. 02/20 22:38
44F：→ tsubasawolfy:平常就 3min當基準往前往後調時間 最多10min 02/20 22:38
45F：推 echo:用 dot blotting 作一次 control 就知道哪裡出問題了~ 02/20 22:42
46F：→ latte366:其實我一開始做 也是從2分鐘開始調時間 只是繳了很多次 02/20 22:44
47F：→ latte366:白卷 就會想壓更久一點看看 那時只是想先看看有沒有band 02/20 22:45
48F：→ latte366:確定抗體OK後 才想進一步調整加的量跟時間 等於是.... 02/20 22:47
49F：→ latte366:我在花錢先看有沒有 再來求好 至少有看到我要的東西了 02/20 22:48
50F：→ latte366:只是會很好奇那個白白的條狀物是什麼 順便跟大家分享 02/20 22:49
51F：→ latte366:"dot blotting"? 頭一次聽到 我去查一下先 感謝^^ 02/20 22:50