作者latte366 ( )
看板Biotech
标题Re: [求救] Western怪怪说
时间Wed Feb 20 21:48:59 2008
※ 引述《Nikio (工作有够忙)》之铭言：
想请教大家一些问题 ><
今天压western很怪，五分钟、十分钟 都一片空白，就狠下心给他压了3小时，
结果整片MEMBRANE都黑了，但跑出了一堆一条条白色的bands，好像位置又是我要的
protein @@ 见鬼，怎麽变成白色的呢？ 对了 连marker也变成白色的
和同学讨论结果可能是：二抗太强，把ECL在压片前就吃光光，可以解释为何第一次压
没压出来但长时间压却变白色的（被HRP吃掉以致於正确位置的protein无法显色）
不过好怪喔～如果说是我要target的protein还解释的通，为何pre-stain也变白的@@?
=========我===========是===========分==========隔===========线===============
吃掉一部份 ^^""
借这个标题想请教一下最近western 的压片问题 (顺便PO个图好让别人当错误参考)
以下连结是压片的结果
http://www.wretch.cc/album/show.php?i=latte0619&b=5&f=1306670456&p=0
问题一:
请问照片中白白一条一条的原因是因为过曝吗?
方法:
压片15min， loading:120ug total protein
一抗用1:500稀释，overnight(16hr)，
(学长是说我一抗加太多了 同学则是说我压太久)
二抗用1:5000稀释，1hr
一抗二抗皆是以5%脱脂奶粉泡在TBS
且wash过程皆是TBST 10min 5次，shaking
transfer: 340mA，1hr，用semi-dry的方式
Blocking: 5%脱脂奶粉泡在TBS，1hr
至於为什麽会loading这麽多protin 因为要看的是membrane上的蛋白
怕她量太少 所以才loading这麽多 (是不是太多了点...orz)
问题二:
加入sample buffer後 煮5min 置於室温 (有另一说法要置於冰上 请问各位怎麽做)
以上两个问题
希望有这方面经验的前辈能给个建议
感恩 ^^
图片欢迎转载 大家一起讨论长知识
=========我===========是===========分==========隔===========线===============
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 211.76.175.170
1F：推 naturer:曝光过度 01/25 19:52
2F：推 a64toto:时效过完加再多也没用喔 01/25 22:06
3F：→ a64toto:可以把ECL跟抗体洗掉重新来一次 01/25 22:06
5F：推 changyaowen:白band通常是太强造成反白 不过压久才出现 需要担心是 01/25 23:00
6F：→ changyaowen:是非专一性出现的band 不然应该一开始就压得出来 01/25 23:01
7F：→ changyaowen:专一性的band应该只会出现一条 短时间>黑 长时间>白 01/25 23:03
8F：推 ralphlee:压片时间太久了 以秒为单位试试看 用个10秒20秒~~ 01/26 10:08
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◆ From: 140.116.93.52
※ 编辑: latte366 来自: 140.116.93.52 (02/20 21:53)
9F：推 bluecsky:靠..1抗1:500就算了..还O/N..你1抗是怎麽来的?纯度不好? 02/20 22:13
10F：→ bluecsky:2抗1:5000也有点多..买来的antibody 1抗1:3000 or 1:5000 02/20 22:14
11F：→ bluecsky:2抗1:10000甚至1:20000都可以.. 02/20 22:14
12F：→ bluecsky:而且protein还load满多量的..你这样的量 02/20 22:15
13F：→ bluecsky:说不定光是压个10秒band都超黑的..= = 02/20 22:15
14F：→ bluecsky:1抗不用到O/N啦..跟二抗一样1小时就好 02/20 22:16
15F：→ latte366:哈 其实我也觉得太多 这是有原因的 以下说明 02/20 22:18
16F：→ bluecsky:不过你压5min没东西.. 02/20 22:19
17F：→ latte366:一开始用santacruze的抗体 loading 40ug protein跑不出来 02/20 22:19
18F：→ bluecsky:看错..5min没东西不是你的问题 02/20 22:20
19F：→ latte366:後来改loading 120ug 就有 可惜杂band太多 02/20 22:20
20F：→ latte366:改ABcam的monlonal clonal Ab後 其实也想过titer 02/20 22:20
21F：→ bluecsky:杂band多..你是抗什麽的?专一性不高搂 02/20 22:21
22F：→ latte366:要不要重测 或许不需要那麽浓 蛋白质也不用loading那麽多 02/20 22:21
23F：→ bluecsky:杂band多可能跟你1抗过多还有时间过久有关吧 02/20 22:22
24F：推 tsubasawolfy:唔 不是有针对膜蛋白的萃取方式? 02/20 22:22
25F：→ bluecsky:protein 40ug做不出可以提升一下量..或许真的很少很少 02/20 22:22
26F：→ latte366:只是因为一些因素 後来还是照原来condition跑 02/20 22:23
27F：→ latte366:b大可以请问您 那一条条白白的是因为一抗太浓吗？ 02/20 22:24
28F：推 bluecsky:我觉得你降低antibody量应该可以提升专一性 02/20 22:24
29F：→ bluecsky:白白的应该是太亮..曝光过久 02/20 22:25
30F：→ bluecsky:就你的图看来真的抓很多莫名其妙的东西的感觉 02/20 22:26
31F：→ bluecsky:你压片压多久? 02/20 22:26
32F：→ latte366:t大 膜蛋白的翠取方式 其实我最近还在看资料 02/20 22:26
33F：→ latte366:之前没做过 所以不敢做 现在的方法是用前人的 02/20 22:26
34F：→ latte366:感谢您b大 我下次试着把一抗二抗降低titer 02/20 22:27
35F：→ latte366:30min 不过 另一个同学 同一支Ab 一抗、二抗1:2000 02/20 22:28
36F：→ latte366:出来的结果就很漂亮 没有我的问题 02/20 22:29
37F：推 bluecsky:压片时间也影响很大..除非量很少要不然基本上压几秒 02/20 22:30
38F：→ bluecsky:顶多到几分钟应该结果都不错 02/20 22:30
39F：→ latte366:打错 是15min 02/20 22:30
40F：→ bluecsky:要不要试试压30秒之类的短时间..说不定就可以了 02/20 22:31
41F：→ latte366:那我懂了 明天再来试试 谢谢两位 ^^ 02/20 22:31
42F：→ latte366:恩恩 OK 我下次试看看 谢谢您 02/20 22:32
43F：推 tsubasawolfy:压超过15min的我就会放弃重做.. 02/20 22:38
44F：→ tsubasawolfy:平常就 3min当基准往前往後调时间 最多10min 02/20 22:38
45F：推 echo:用 dot blotting 作一次 control 就知道哪里出问题了~ 02/20 22:42
46F：→ latte366:其实我一开始做 也是从2分钟开始调时间 只是缴了很多次 02/20 22:44
47F：→ latte366:白卷 就会想压更久一点看看 那时只是想先看看有没有band 02/20 22:45
48F：→ latte366:确定抗体OK後 才想进一步调整加的量跟时间 等於是.... 02/20 22:47
49F：→ latte366:我在花钱先看有没有 再来求好 至少有看到我要的东西了 02/20 22:48
50F：→ latte366:只是会很好奇那个白白的条状物是什麽 顺便跟大家分享 02/20 22:49
51F：→ latte366:"dot blotting"? 头一次听到 我去查一下先 感谢^^ 02/20 22:50