> ※ 引述《Nikio (工作有夠忙)》之銘言： > 想請教大家一些問題 >< > 今天壓western很怪，五分鐘、十分鐘 都一片空白，就狠下心給他壓了3小時， > 結果整片MEMBRANE都黑了，但跑出了一堆一條條白色的bands，好像位置又是我要的 > protein @@ 見鬼，怎麼變成白色的呢？ 對了 連marker也變成白色的 > 和同學討論結果可能是：二抗太強，把ECL在壓片前就吃光光，可以解釋為何第一次 > 壓沒壓出來但長時間壓卻變白色的（被HRP吃掉以致於正確位置的protein無法顯色） > 不過好怪喔～如果說是我要target的protein還解釋的通，為何pre-stain也變白的 如果是壓了那麼久結果反白 而且除了預期的 笨的 以外 還有很多額外的白色 笨的 連 媽可 都有（我預期你用的 媽可 本來應該是不會被二抗認到的吧？） 則我認為是你 村死否 完以後沒有 補辣可 好 所以一抗或二抗就黏到沒有蛋白質的地方了 當然 考慮到你壓了那麼久 其實那根本可以看成只是合理程度的背景而已 > 借這個標題想請教一下最近western 的壓片問題 (順便PO個圖好讓別人當錯誤參考) > 以下連結是壓片的結果 > http://www.wretch.cc/album/show.php?i=latte0619&b=5&f=1306670456&p=0 > 問題一: > 請問照片中白白一條一條的原因是因為過曝嗎? 如上解 圖中黑色的 笨的 看起來很正常啊 強度也比你的背景強很多 我覺得只要不壓那麼久問題就可以解決了 > 方法: > 壓片15min， loading:120ug total protein > 一抗用1:500稀釋，overnight(16hr)， > (學長是說我一抗加太多了 同學則是說我壓太久) 看說明書 不過一般來講一抗加到 1:500, 除非真的是很鳥的一抗.... 要不然就是太濃了 > 二抗用1:5000稀釋，1hr 也滿濃的 抗體不是滴滴香醇意猶未盡越濃越好喔 > 一抗二抗皆是以5%脫脂奶粉泡在TBS > 且wash過程皆是TBST 10min 5次，shaking > transfer: 340mA，1hr，用semi-dry的方式 > Blocking: 5%脫脂奶粉泡在TBS，1hr > 至於為什麼會loading這麼多protin 因為要看的是membrane上的蛋白 > 怕她量太少 所以才loading這麼多 (是不是太多了點...orz) 改用血清作 補辣可 可能更好 對了你一抗二抗用什麼物種？ 一抗是綿羊的話 不適合用牛奶作 補辣可喔 因為抗綿羊抗體的二抗也會認牛奶裡的什麼東西 > 問題二: > 加入sample buffer後 煮5min 置於室溫 (有另一說法要置於冰上 請問各位怎麼做) > 以上兩個問題 沒差 除非你是做超級脆弱的蛋白質或者是要看 否死罘瑞累宣 --- 對不起我今天生病了 生了一種喜歡用中文拼寫英文的病............................ -- 莫非定律: 到了期末才會想起期初曾選了一門課卻一直沒去上 補充定律: 拿到成績單才發現上了一學期的課忘了去考期末考 -- ※ Origin: 生命科學 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> ◆ From: boblu.STUDENT.CWRU.Edu