> ※ 引述《Nikio (工作有够忙)》之铭言： > 想请教大家一些问题 >< > 今天压western很怪，五分钟、十分钟 都一片空白，就狠下心给他压了3小时， > 结果整片MEMBRANE都黑了，但跑出了一堆一条条白色的bands，好像位置又是我要的 > protein @@ 见鬼，怎麽变成白色的呢？ 对了 连marker也变成白色的 > 和同学讨论结果可能是：二抗太强，把ECL在压片前就吃光光，可以解释为何第一次 > 压没压出来但长时间压却变白色的（被HRP吃掉以致於正确位置的protein无法显色） > 不过好怪喔～如果说是我要target的protein还解释的通，为何pre-stain也变白的 如果是压了那麽久结果反白 而且除了预期的 笨的 以外 还有很多额外的白色 笨的 连 妈可 都有（我预期你用的 妈可 本来应该是不会被二抗认到的吧？） 则我认为是你 村死否 完以後没有 补辣可 好 所以一抗或二抗就黏到没有蛋白质的地方了 当然 考虑到你压了那麽久 其实那根本可以看成只是合理程度的背景而已 > 借这个标题想请教一下最近western 的压片问题 (顺便PO个图好让别人当错误参考) > 以下连结是压片的结果 > http://www.wretch.cc/album/show.php?i=latte0619&b=5&f=1306670456&p=0 > 问题一: > 请问照片中白白一条一条的原因是因为过曝吗? 如上解 图中黑色的 笨的 看起来很正常啊 强度也比你的背景强很多 我觉得只要不压那麽久问题就可以解决了 > 方法: > 压片15min， loading:120ug total protein > 一抗用1:500稀释，overnight(16hr)， > (学长是说我一抗加太多了 同学则是说我压太久) 看说明书 不过一般来讲一抗加到 1:500, 除非真的是很鸟的一抗.... 要不然就是太浓了 > 二抗用1:5000稀释，1hr 也满浓的 抗体不是滴滴香醇意犹未尽越浓越好喔 > 一抗二抗皆是以5%脱脂奶粉泡在TBS > 且wash过程皆是TBST 10min 5次，shaking > transfer: 340mA，1hr，用semi-dry的方式 > Blocking: 5%脱脂奶粉泡在TBS，1hr > 至於为什麽会loading这麽多protin 因为要看的是membrane上的蛋白 > 怕她量太少 所以才loading这麽多 (是不是太多了点...orz) 改用血清作 补辣可 可能更好 对了你一抗二抗用什麽物种？ 一抗是绵羊的话 不适合用牛奶作 补辣可喔 因为抗绵羊抗体的二抗也会认牛奶里的什麽东西 > 问题二: > 加入sample buffer後 煮5min 置於室温 (有另一说法要置於冰上 请问各位怎麽做) > 以上两个问题 没差 除非你是做超级脆弱的蛋白质或者是要看 否死罘瑞累宣 --- 对不起我今天生病了 生了一种喜欢用中文拼写英文的病............................ -- 莫非定律: 到了期末才会想起期初曾选了一门课却一直没去上 补充定律: 拿到成绩单才发现上了一学期的课忘了去考期末考 -- ※ Origin: 生命科学 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> ◆ From: boblu.STUDENT.CWRU.Edu