※ 引述《[email protected] (六百)》之銘言： : > 想請教大家一些問題 >< : > 今天壓western很怪，五分鐘、十分鐘 都一片空白，就狠下心給他壓了3小時， : > 結果整片MEMBRANE都黑了，但跑出了一堆一條條白色的bands，好像位置又是我要的 : > protein @@ 見鬼，怎麼變成白色的呢？ 對了 連marker也變成白色的 : > 和同學討論結果可能是：二抗太強，把ECL在壓片前就吃光光，可以解釋為何第一次 : > 壓沒壓出來但長時間壓卻變白色的（被HRP吃掉以致於正確位置的protein無法顯色） : > 不過好怪喔～如果說是我要target的protein還解釋的通，為何pre-stain也變白的 : 如果是壓了那麼久結果反白 : 而且除了預期的 笨的 以外 還有很多額外的白色 笨的 : 連 媽可 都有（我預期你用的 媽可 本來應該是不會被二抗認到的吧？） : 則我認為是你 村死否 完以後沒有 補辣可 好 : 所以一抗或二抗就黏到沒有蛋白質的地方了 : 當然 考慮到你壓了那麼久 : 其實那根本可以看成只是合理程度的背景而已 您是轉信的 推文會看不到 所以我就直接回文啦 上面是不認識的人的問題 在這裡替他感謝您提供意見 ^^ : > 借這個標題想請教一下最近western 的壓片問題 (順便PO個圖好讓別人當錯誤參考) : > 以下連結是壓片的結果 : > http://www.wretch.cc/album/show.php?i=latte0619&b=5&f=1306670456&p=0 : > 問題一: : > 請問照片中白白一條一條的原因是因為過曝嗎? : 如上解 : 圖中黑色的 笨的 看起來很正常啊 強度也比你的背景強很多 : 我覺得只要不壓那麼久問題就可以解決了 這隻抗體那時第一次測 我也恨我為什麼那時不從短時間開始壓就好.....Orz : > 方法: : > 壓片15min， loading:120ug total protein : > 一抗用1:500稀釋，overnight(16hr)， : > (學長是說我一抗加太多了 同學則是說我壓太久) : 看說明書 : 不過一般來講一抗加到 1:500, 除非真的是很鳥的一抗.... 要不然就是太濃了 : > 二抗用1:5000稀釋，1hr : 也滿濃的 : 抗體不是滴滴香醇意猶未盡越濃越好喔 其實那時一抗選1:500還有個原因 就是他的data sheet建議 1：100～1：500 我做完的隔一個星期 同實驗室同學的用1:2000就抓的到了 所以說加的量 果然還是得實際自己做過才抓的準 另外 二抗的濃度就真的是我猜的了 我同學用1:2000二抗（濃到炸了吧）backgroound並不會很黑 也沒一堆雜band 我是覺得挺羅生門的 但要我解釋 我又說不出個所以然 其實做實驗這樣不好 應該是要序列稀釋後 取幾個titer的量去看 抓一個最好的condition 不過 錯誤中學習也是一種機會教育啦 （謎之聲 老闆的錢就是這樣流掉的....T_T) : > 一抗二抗皆是以5%脫脂奶粉泡在TBS : > 且wash過程皆是TBST 10min 5次，shaking : > transfer: 340mA，1hr，用semi-dry的方式 : > Blocking: 5%脫脂奶粉泡在TBS，1hr : > 至於為什麼會loading這麼多protin 因為要看的是membrane上的蛋白 : > 怕她量太少 所以才loading這麼多 (是不是太多了點...orz) : 改用血清作 補辣可 可能更好 : 對了你一抗二抗用什麼物種？ : 一抗是綿羊的話 不適合用牛奶作 補辣可喔 : 因為抗綿羊抗體的二抗也會認牛奶裡的什麼東西 血清(指BSA嗎） 有機會的話偷一館來試試 雖然貴了點......T_T 一抗是 mouse monoclonal Ab (anti-neuregulin Ab) 二抗是 donkey anti mouse Ab-Hrp : > 問題二: : > 加入sample buffer後 煮5min 置於室溫 (有另一說法要置於冰上 請問各位怎麼做) : > 以上兩個問題 : 沒差 : 除非你是做超級脆弱的蛋白質或者是要看 否死罘瑞累宣 : --- : 對不起我今天生病了 : 生了一種喜歡用中文拼寫英文的病............................ 沒關係 我看的懂 呵呵 --

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