※ 引述《[email protected] (六百)》之铭言： : > 想请教大家一些问题 >< : > 今天压western很怪，五分钟、十分钟 都一片空白，就狠下心给他压了3小时， : > 结果整片MEMBRANE都黑了，但跑出了一堆一条条白色的bands，好像位置又是我要的 : > protein @@ 见鬼，怎麽变成白色的呢？ 对了 连marker也变成白色的 : > 和同学讨论结果可能是：二抗太强，把ECL在压片前就吃光光，可以解释为何第一次 : > 压没压出来但长时间压却变白色的（被HRP吃掉以致於正确位置的protein无法显色） : > 不过好怪喔～如果说是我要target的protein还解释的通，为何pre-stain也变白的 : 如果是压了那麽久结果反白 : 而且除了预期的 笨的 以外 还有很多额外的白色 笨的 : 连 妈可 都有（我预期你用的 妈可 本来应该是不会被二抗认到的吧？） : 则我认为是你 村死否 完以後没有 补辣可 好 : 所以一抗或二抗就黏到没有蛋白质的地方了 : 当然 考虑到你压了那麽久 : 其实那根本可以看成只是合理程度的背景而已 您是转信的 推文会看不到 所以我就直接回文啦 上面是不认识的人的问题 在这里替他感谢您提供意见 ^^ : > 借这个标题想请教一下最近western 的压片问题 (顺便PO个图好让别人当错误参考) : > 以下连结是压片的结果 : > http://www.wretch.cc/album/show.php?i=latte0619&b=5&f=1306670456&p=0 : > 问题一: : > 请问照片中白白一条一条的原因是因为过曝吗? : 如上解 : 图中黑色的 笨的 看起来很正常啊 强度也比你的背景强很多 : 我觉得只要不压那麽久问题就可以解决了 这只抗体那时第一次测 我也恨我为什麽那时不从短时间开始压就好.....Orz : > 方法: : > 压片15min， loading:120ug total protein : > 一抗用1:500稀释，overnight(16hr)， : > (学长是说我一抗加太多了 同学则是说我压太久) : 看说明书 : 不过一般来讲一抗加到 1:500, 除非真的是很鸟的一抗.... 要不然就是太浓了 : > 二抗用1:5000稀释，1hr : 也满浓的 : 抗体不是滴滴香醇意犹未尽越浓越好喔 其实那时一抗选1:500还有个原因 就是他的data sheet建议 1：100～1：500 我做完的隔一个星期 同实验室同学的用1:2000就抓的到了 所以说加的量 果然还是得实际自己做过才抓的准 另外 二抗的浓度就真的是我猜的了 我同学用1:2000二抗（浓到炸了吧）backgroound并不会很黑 也没一堆杂band 我是觉得挺罗生门的 但要我解释 我又说不出个所以然 其实做实验这样不好 应该是要序列稀释後 取几个titer的量去看 抓一个最好的condition 不过 错误中学习也是一种机会教育啦 （谜之声 老板的钱就是这样流掉的....T_T) : > 一抗二抗皆是以5%脱脂奶粉泡在TBS : > 且wash过程皆是TBST 10min 5次，shaking : > transfer: 340mA，1hr，用semi-dry的方式 : > Blocking: 5%脱脂奶粉泡在TBS，1hr : > 至於为什麽会loading这麽多protin 因为要看的是membrane上的蛋白 : > 怕她量太少 所以才loading这麽多 (是不是太多了点...orz) : 改用血清作 补辣可 可能更好 : 对了你一抗二抗用什麽物种？ : 一抗是绵羊的话 不适合用牛奶作 补辣可喔 : 因为抗绵羊抗体的二抗也会认牛奶里的什麽东西 血清(指BSA吗） 有机会的话偷一馆来试试 虽然贵了点......T_T 一抗是 mouse monoclonal Ab (anti-neuregulin Ab) 二抗是 donkey anti mouse Ab-Hrp : > 问题二: : > 加入sample buffer後 煮5min 置於室温 (有另一说法要置於冰上 请问各位怎麽做) : > 以上两个问题 : 没差 : 除非你是做超级脆弱的蛋白质或者是要看 否死罘瑞累宣 : --- : 对不起我今天生病了 : 生了一种喜欢用中文拼写英文的病............................ 没关系 我看的懂 呵呵 --

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