這個問題再次重伸 首先專員來兩次 第二次待一整天 結果有些還是沒出來 單個SAMPLE有很多波峰 那是不是 每個PRIMER都有固定的波峰 跑膠結果 有些沒東西 或者是其他雜BAND 說我們環境太雜 但問題是跑RT-PCR就不會有這種狀況 之後電話聯絡 建議我們換抽RNA的KIT 之前是用傳統方式抽的(TRIZOL) 結果還是沒有預期產物 有什麼理由是買機器的公司要負責試 如果她們完完整整跑出來一次 DATE都很漂亮 我會來這 照做就好了 做不出來是自己的問題 ※ 引述《leftt (left)》之銘言： : 原PO的問題應該是不懂realtimePCR : 而且是整個公司都不太懂 : 然後ROCHE的專員跟版眾一樣 秀才遇到兵 呵呵 : 如果搞不懂 換AB, BioRad的realtime機器也是一樣 : 八連排的tube 出來的data也不會比較漂亮唷 : 而且AB的試劑也沒有便宜到哪裡去吧 : 幾個重點 : 1.realtimePCR本來就可以做診斷 : 就我所知疾管局就有用 當年診斷SARS時也很風光 : 你可以帶隊殺去學的地方其實還不少 : 問題是 一般人都只願意帶學習態度誠懇的人做實驗吧 我們不需要那麼風光 當首例 這個我要問一下 SARS當初如果用RT-PCR做的出來嗎 : 2.RT-PCR跑膠有band所以你認為診斷正確 不需要sequence就可以 : 但是你怎麼知道你哪個band是正確的放大標的物? : 也許是數個尺寸一樣但是內容不同的放大產物混合在一起勒 : realtimePCR可以利用melting curve偵測是否為單一純產物 這個我不懂 因為 既然melting curve可以判斷是否為純產物 那如果melting curve 就是一樣的產物嗎 : 3.毛細管的產物也可以抽出來跑電泳 : 如果你們實驗設計是正確的 那這個電泳產物和RT-PCR的產物應該是要一致的 : 普通PCR的primer也可以試跑realtimePCR的 : 有時候你可以發現原來先前跑普通PCR的primer是大大的有問題 : 可能是產物不對 也可能有嚴重的primer dimer DIMER的問題已經解決了 現在同一SAMPLE 再試第三組PRIMER : 4.過了melting curve後整個螢光值掉下來 : 請先了解melting curve的定義以及用途 : 還有螢光染劑發光的原理及時機 : 5.分子生物學實驗本來就要求較純的原料 : 因為在放大檢測的狀況 一點細微的誤差很容易就被無限放大而蓋住原有資料 : 普通 PCR也無法忍受亂七八糟的檢體吧 只是他出錯的時候比較不容易被發現 : 相對而言 data也比較不可信賴 : 如果目標真的不好偵測 也許不要用SyBr 換TaqMan probe看看 : 正確率也許高一點 要花錢 這個我不提 : 6.realtimePCR的確為快速診斷的工具 : 如果你了解早期診斷的工具就知道 有些病毒培養確認動輒是兩週三週的時間 : 跑realtimePCR可以縮短到數小時即有結果 : 而ROCHE毛細管PCR由於是空氣加熱 升降溫快速 cycle time較一般機器短 : 說快速也沒錯 早期診斷 通常有症狀才會要我們去 所以用RT-PCR都做的出來 初非是很奇怪的SAMPLE 所以有培養設備 但不養 : 你們的問題是出在對實驗原理不了解 : 其實只要找一個學分生的 有在作realtimePCR的 : 花個幾天時間大概就可以找出毛病在哪裡 : 對於會用的人 來兩次了 還是沒解決問題 倒是建議我們換抽RNA的KIT : LightCycler其實挺好用的 介面也比較親切 : 可是對於不懂也不願意去學的人 : 那只是一台一百多萬的小電鍋而已 而且還會狂吃耗材錢唷 : ※ 引述《micocat (de novo)》之銘言： : : RT-PCR 跟real-time pcr的要求是不一樣的 : : 我們實驗室有遇過同樣的primer RT做的出來，real-time卻p不到的情形 : : 後來換了primer就解決了 : : 建議可以換組primer試試 --

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