这个问题再次重伸 首先专员来两次 第二次待一整天 结果有些还是没出来 单个SAMPLE有很多波峰 那是不是 每个PRIMER都有固定的波峰 跑胶结果 有些没东西 或者是其他杂BAND 说我们环境太杂 但问题是跑RT-PCR就不会有这种状况 之後电话联络 建议我们换抽RNA的KIT 之前是用传统方式抽的(TRIZOL) 结果还是没有预期产物 有什麽理由是买机器的公司要负责试 如果她们完完整整跑出来一次 DATE都很漂亮 我会来这 照做就好了 做不出来是自己的问题 ※ 引述《leftt (left)》之铭言： : 原PO的问题应该是不懂realtimePCR : 而且是整个公司都不太懂 : 然後ROCHE的专员跟版众一样 秀才遇到兵 呵呵 : 如果搞不懂 换AB, BioRad的realtime机器也是一样 : 八连排的tube 出来的data也不会比较漂亮唷 : 而且AB的试剂也没有便宜到哪里去吧 : 几个重点 : 1.realtimePCR本来就可以做诊断 : 就我所知疾管局就有用 当年诊断SARS时也很风光 : 你可以带队杀去学的地方其实还不少 : 问题是 一般人都只愿意带学习态度诚恳的人做实验吧 我们不需要那麽风光 当首例 这个我要问一下 SARS当初如果用RT-PCR做的出来吗 : 2.RT-PCR跑胶有band所以你认为诊断正确 不需要sequence就可以 : 但是你怎麽知道你哪个band是正确的放大标的物? : 也许是数个尺寸一样但是内容不同的放大产物混合在一起勒 : realtimePCR可以利用melting curve侦测是否为单一纯产物 这个我不懂 因为 既然melting curve可以判断是否为纯产物 那如果melting curve 就是一样的产物吗 : 3.毛细管的产物也可以抽出来跑电泳 : 如果你们实验设计是正确的 那这个电泳产物和RT-PCR的产物应该是要一致的 : 普通PCR的primer也可以试跑realtimePCR的 : 有时候你可以发现原来先前跑普通PCR的primer是大大的有问题 : 可能是产物不对 也可能有严重的primer dimer DIMER的问题已经解决了 现在同一SAMPLE 再试第三组PRIMER : 4.过了melting curve後整个萤光值掉下来 : 请先了解melting curve的定义以及用途 : 还有萤光染剂发光的原理及时机 : 5.分子生物学实验本来就要求较纯的原料 : 因为在放大检测的状况 一点细微的误差很容易就被无限放大而盖住原有资料 : 普通 PCR也无法忍受乱七八糟的检体吧 只是他出错的时候比较不容易被发现 : 相对而言 data也比较不可信赖 : 如果目标真的不好侦测 也许不要用SyBr 换TaqMan probe看看 : 正确率也许高一点 要花钱 这个我不提 : 6.realtimePCR的确为快速诊断的工具 : 如果你了解早期诊断的工具就知道 有些病毒培养确认动辄是两周三周的时间 : 跑realtimePCR可以缩短到数小时即有结果 : 而ROCHE毛细管PCR由於是空气加热 升降温快速 cycle time较一般机器短 : 说快速也没错 早期诊断 通常有症状才会要我们去 所以用RT-PCR都做的出来 初非是很奇怪的SAMPLE 所以有培养设备 但不养 : 你们的问题是出在对实验原理不了解 : 其实只要找一个学分生的 有在作realtimePCR的 : 花个几天时间大概就可以找出毛病在哪里 : 对於会用的人 来两次了 还是没解决问题 倒是建议我们换抽RNA的KIT : LightCycler其实挺好用的 介面也比较亲切 : 可是对於不懂也不愿意去学的人 : 那只是一台一百多万的小电锅而已 而且还会狂吃耗材钱唷 : ※ 引述《micocat (de novo)》之铭言： : : RT-PCR 跟real-time pcr的要求是不一样的 : : 我们实验室有遇过同样的primer RT做的出来，real-time却p不到的情形 : : 後来换了primer就解决了 : : 建议可以换组primer试试 --

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