作者ayinie (諸事不順啊~~~)
看板Biotech
標題[求救] 抽不到RNA
時間Mon Mar 3 20:26:43 2008
我是從組織抽RNA來測是否有感染某病毒
以前抽RNA一直都沒問題
可是這陣子老是抽不到
就是連β-actin都沒有
我不知道問題出在哪?
我都是照實驗室"祖傳"步驟在做
先排除掉DEPC水和tip等器材是否污染的問題
因為實驗室其它人在抽也都是用同樣的設備同樣的DEPC水
可是他們都抽得到
我目前發現一個問題
就是加完isopropanol放置-70度超過20分鐘後離心
離心完都會有白白的pellet
學姐說她們做也會有
可是她們的pellet在酒精沉澱後烘乾時就會熔掉了
或者烘乾完加了DEPC水後pellet也會自動溶掉
問題來了
我的pellet根本溶不掉!!
我重做了好幾次
有的sample最後總算有抽到
有的sample仍舊沒有
我發現pellet有溶掉的最後跑RT-PCR都跑得出來
可是pellet沒溶掉的就跑不出東西來了
就是連β-actin都沒有
酒精沉澱後我以50度加熱到整個eppendorf完全乾掉
但是pellet仍舊沒有熔掉
加入DEPC水後以手指敲打
有的pellet總算溶掉
有的還是溶不掉
繼續加熱一陣子pellet還是溶不掉
奇怪的是我抽RNA也抽了半年有了
之前都沒這問題呀
學姐說pellet溶不掉表示那是蛋白
可是前面用trizol和chloroform沉澱蛋白的步驟我都沒有做錯
離心完吸取上清液也絕不可能吸到蛋白層(因為上清液很多)
我快瘋了啦~~~~
我完全不知道問題出在哪
為什麼會有那些溶不掉的pellet?!
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.117.178
1F：推 aggaci:應該是酒精dry太久了...抽風dry個5分鐘就可以回溶 03/03 20:31
2F：→ ayinie:我還做過烘乾2分鐘 照樣溶不掉pellet 03/03 21:06
3F：→ ayinie:5分鐘我也試過 有的溶得掉有的溶不掉 可是學姐說她曾經 03/03 21:08
4F：→ ayinie:放過30分鐘還是很ok 03/03 21:08
5F：推 iamonster:好了 03/03 22:03
6F：推 micocat:酒精風乾時不要完全乾掉 RNA乾掉的話溶解度很差 03/04 02:36
7F：推 bicon:酒精wash後，倒掉酒精(一定倒不乾淨)，之後再離心 03/04 13:00
8F：→ bicon:用tip把剩餘酒精吸起來，可以吸的很乾淨。 03/04 13:01
9F：→ bicon:air dry，5 分鐘就乾了。 03/04 13:01
10F：→ bicon:我們家RNA 是會在4度C 回溶 overnight 03/04 13:02
11F：推 meiosisLin:我的作法，酒精抽掉，air dry就好.......不太需要抽氣 03/04 22:39
12F：→ meiosisLin:烘乾，然後加水在室溫或是55度回溶都OK 03/04 22:40
13F：推 zoom8080:回溶記得用pipette打個十來下 會溶的比較好喔~~ 03/04 22:43