※ 引述《kvw (Je t'aime)》之銘言： : 最近在做5' RACE PCR : 用的是Roche 5'/3' RACE kit : 我先用一個reverse primer 1 (R1)將RNA轉成cDNA後 : 再讓cDNA接上poly A tail : 之後再用oligo-dT anchor primer與reverse primer 1(R1) and 2(R2)去做PCR : 結果到這邊只有出現primer dimer 請問一下R1,R2應該是你自己根據template設計的specific primer是嗎... 那會出現dimer應該是primer(R1 or R2)設計不良,與oligo-dT anchor primer形成dimer.. 當你用oligo-dT anchor primer與R2做完PCR之後... 下一步應該是用PCR anchor primer與R3去跑PCR... (R3比R2 nest) : 之後老闆要我再做一次nested PCR : 就是用PCR anchor primer與reverse primer 2 (R2)去跑 : 結果反而出現smear的現象 smear的情形還要看看是出現多條band或是整個都糊糊的... 出現多條band的情形多發生在於你的RACE目標太長,cDNA產物長度多樣... 若是目標介於1-2K bp之間通常會有單一band較強... 糊糊的話就建議進行nest PCR... 如果你先前使用的primer是R2跟PCR anchor primer的話... Nest建議你使用R3與PCR anchor primer會比較好(畢竟是Nest PCR)... : 第一次的PCR product也照kit protocol寫的做了1:20倍的稀釋 : 還是一樣出現smear的情形 : 請問一下有人做到5' RACE PCR嗎? : 實在不懂哪裡出了問題 是RNA轉cDNA部分沒做好嗎? 沒做好不會出現產物,也不會糊糊的... : 因為原本懷疑是在cDNA接上poly A tail這邊的問題 : 結果重新做了一次還是一樣 以我的經驗這邊不太可能會出現問題,除非你oligo-dT anchor primer壞掉... : kit上面說可以直接用oligo-dT anchor primer與reverse primer 2 : 就可以直接夾到所要的片段 真的可以這樣就做出來嗎? Kit說可以一次夾出來是理想化情形... 你的目標要夠短,R2夠專一... : 我們家老闆說不可能 那這樣還要anchor primer幹麻 : 拜託有沒有做過5' RACE PCR的人可以幫我一下 謝謝~ 你注意一下oligo-dT anchor primer與PCR anchor primer之間的差異只有那些T... oligo-dT anchor primer的用意在於製造出可以使PCR anchor primer黏接上的template 不然的話以5'UTR的多樣性你根本不可能設計出一個通用的primer進行擴增... (要說以oligo-dT anchor primer做就好而不用PCR anchor primer, 就不能排除掉那一串T帶來的實驗誤差) 所以最重要的是當你得到序列之後... 你要扣掉PCR anchor primer的序列才是你真正要clone的sequence... 有聽沒有懂?做到這邊你就知道了(笑)... --

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