※ 引述《kvw (Je t'aime)》之铭言： : 最近在做5' RACE PCR : 用的是Roche 5'/3' RACE kit : 我先用一个reverse primer 1 (R1)将RNA转成cDNA後 : 再让cDNA接上poly A tail : 之後再用oligo-dT anchor primer与reverse primer 1(R1) and 2(R2)去做PCR : 结果到这边只有出现primer dimer 请问一下R1,R2应该是你自己根据template设计的specific primer是吗... 那会出现dimer应该是primer(R1 or R2)设计不良,与oligo-dT anchor primer形成dimer.. 当你用oligo-dT anchor primer与R2做完PCR之後... 下一步应该是用PCR anchor primer与R3去跑PCR... (R3比R2 nest) : 之後老板要我再做一次nested PCR : 就是用PCR anchor primer与reverse primer 2 (R2)去跑 : 结果反而出现smear的现象 smear的情形还要看看是出现多条band或是整个都糊糊的... 出现多条band的情形多发生在於你的RACE目标太长,cDNA产物长度多样... 若是目标介於1-2K bp之间通常会有单一band较强... 糊糊的话就建议进行nest PCR... 如果你先前使用的primer是R2跟PCR anchor primer的话... Nest建议你使用R3与PCR anchor primer会比较好(毕竟是Nest PCR)... : 第一次的PCR product也照kit protocol写的做了1:20倍的稀释 : 还是一样出现smear的情形 : 请问一下有人做到5' RACE PCR吗? : 实在不懂哪里出了问题 是RNA转cDNA部分没做好吗? 没做好不会出现产物,也不会糊糊的... : 因为原本怀疑是在cDNA接上poly A tail这边的问题 : 结果重新做了一次还是一样 以我的经验这边不太可能会出现问题,除非你oligo-dT anchor primer坏掉... : kit上面说可以直接用oligo-dT anchor primer与reverse primer 2 : 就可以直接夹到所要的片段 真的可以这样就做出来吗? Kit说可以一次夹出来是理想化情形... 你的目标要够短,R2够专一... : 我们家老板说不可能 那这样还要anchor primer干麻 : 拜托有没有做过5' RACE PCR的人可以帮我一下 谢谢~ 你注意一下oligo-dT anchor primer与PCR anchor primer之间的差异只有那些T... oligo-dT anchor primer的用意在於制造出可以使PCR anchor primer黏接上的template 不然的话以5'UTR的多样性你根本不可能设计出一个通用的primer进行扩增... (要说以oligo-dT anchor primer做就好而不用PCR anchor primer, 就不能排除掉那一串T带来的实验误差) 所以最重要的是当你得到序列之後... 你要扣掉PCR anchor primer的序列才是你真正要clone的sequence... 有听没有懂?做到这边你就知道了(笑)... --

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