作者ayinie (心力交瘁........)
看板Biotech
標題[求救] 蛋白純化imidazole的濃度
時間Fri Mar 7 20:43:48 2008
我的蛋白是接在pET28b帶有6-His tag
使用Ni-NTA純化蛋白
之前使用Lysis 10mM/10ml、Wash 20mM/20ml、Elution 250mM/3ml
結果每次跑膠染comassie blue出來都會有兩條bands
一條在44kD是我的目標蛋白
一條在17kD不知是啥鬼
這兩條band染色結果是差不多粗
可是做Western以Anti-His去認的話可發現17kD那條band非常非常地淡
怎麼看都不太可能是我的蛋白斷掉的片段
想請教的是...
會不會是因為我在純化的過程imidazole濃度跳太多(20mM→250mM)？
我現在想試試看改成10mM、20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM
那麼50mM、100mM、150mM、200mM這些的體積分別要加多少比較好？
謝謝！
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◆ From: 140.120.117.178
1F：推 bluecsky:有這麼不純嗎?分這麼多梯階還滿麻煩的..配藥麻煩 03/08 07:54
2F：→ bluecsky:我的建議是..你用20 40 80mM做wash elution一樣250mM 03/08 07:55
3F：→ bluecsky:我經驗是100mM以上差不多都流光了啦..100~250這邊分梯階 03/08 07:56
4F：→ bluecsky:好像有點沒意義..不過純化都是case by case.. 03/08 07:56
5F：→ bluecsky:你喜歡的話也可以試試..體積的話就wash的以2倍到4倍 03/08 07:57
6F：→ bluecsky:column體積..elution就1倍或0.5倍column體積 03/08 07:58
7F：推 bluecsky:還有..假如只有這兩條band的話..其實你可以用透析膜 03/08 08:00
8F：→ bluecsky:直接分開他們..他們大小還算差滿多的..用透析膜分離他們 03/08 08:00
9F：推 pizzicato:透析膜的分離效率並不是很好喔 通常會流過但是過很慢 03/08 11:59
10F：推 mournermind:問一下..17KD的蛋白會通過一般透析模嗎? 03/08 15:07
11F：→ mournermind:還是說要用孔較大的透析模呢? 謝謝唷.. 03/08 15:08
12F：推 mournermind:對了想到~我的host cell Novablue也在17KD有東西.. 03/08 15:12
13F：推 sMallhaOnPtt:那一條17kDa不知道會不會是非專一性的binding 03/08 20:22
14F：→ sMallhaOnPtt:在你的wash buffer裡 加一點NaCl 搞不好可以洗掉 03/08 20:24
15F：→ sMallhaOnPtt:濃度可以用個150mM or 300mM 我個人是有用到500mM 03/08 20:24
16F：→ sMallhaOnPtt:不過要看你對你的蛋白有沒有什麼影響 case by case 03/08 20:25
17F：推 pan7353: 如果用AMYCON之類的東西分開勒 03/09 10:53