作者ayinie (心力交瘁........)
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标题[求救] 蛋白纯化imidazole的浓度
时间Fri Mar 7 20:43:48 2008
我的蛋白是接在pET28b带有6-His tag
使用Ni-NTA纯化蛋白
之前使用Lysis 10mM/10ml、Wash 20mM/20ml、Elution 250mM/3ml
结果每次跑胶染comassie blue出来都会有两条bands
一条在44kD是我的目标蛋白
一条在17kD不知是啥鬼
这两条band染色结果是差不多粗
可是做Western以Anti-His去认的话可发现17kD那条band非常非常地淡
怎麽看都不太可能是我的蛋白断掉的片段
想请教的是...
会不会是因为我在纯化的过程imidazole浓度跳太多(20mM→250mM)？
我现在想试试看改成10mM、20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM
那麽50mM、100mM、150mM、200mM这些的体积分别要加多少比较好？
谢谢！
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.120.117.178
1F：推 bluecsky:有这麽不纯吗?分这麽多梯阶还满麻烦的..配药麻烦 03/08 07:54
2F：→ bluecsky:我的建议是..你用20 40 80mM做wash elution一样250mM 03/08 07:55
3F：→ bluecsky:我经验是100mM以上差不多都流光了啦..100~250这边分梯阶 03/08 07:56
4F：→ bluecsky:好像有点没意义..不过纯化都是case by case.. 03/08 07:56
5F：→ bluecsky:你喜欢的话也可以试试..体积的话就wash的以2倍到4倍 03/08 07:57
6F：→ bluecsky:column体积..elution就1倍或0.5倍column体积 03/08 07:58
7F：推 bluecsky:还有..假如只有这两条band的话..其实你可以用透析膜 03/08 08:00
8F：→ bluecsky:直接分开他们..他们大小还算差满多的..用透析膜分离他们 03/08 08:00
9F：推 pizzicato:透析膜的分离效率并不是很好喔 通常会流过但是过很慢 03/08 11:59
10F：推 mournermind:问一下..17KD的蛋白会通过一般透析模吗? 03/08 15:07
11F：→ mournermind:还是说要用孔较大的透析模呢? 谢谢唷.. 03/08 15:08
12F：推 mournermind:对了想到~我的host cell Novablue也在17KD有东西.. 03/08 15:12
13F：推 sMallhaOnPtt:那一条17kDa不知道会不会是非专一性的binding 03/08 20:22
14F：→ sMallhaOnPtt:在你的wash buffer里 加一点NaCl 搞不好可以洗掉 03/08 20:24
15F：→ sMallhaOnPtt:浓度可以用个150mM or 300mM 我个人是有用到500mM 03/08 20:24
16F：→ sMallhaOnPtt:不过要看你对你的蛋白有没有什麽影响 case by case 03/08 20:25
17F：推 pan7353: 如果用AMYCON之类的东西分开勒 03/09 10:53