可以用AKTAprime先跑個gradient 就能找出每種protein的elution conc. 不同protein的binding能力不同 我做過的protein從65 mM ~ 150 mM 都有 所以一定要先測過 不過其實這樣也不一定能拿到很純的protein 如果妳的protein binding 能力低於 non-specific binding 那就很抱歉啦 換種方法吧 ※ 引述《ayinie (心力交瘁........)》之銘言： : 我的蛋白是接在pET28b帶有6-His tag : 使用Ni-NTA純化蛋白 : 之前使用Lysis 10mM/10ml、Wash 20mM/20ml、Elution 250mM/3ml : 結果每次跑膠染comassie blue出來都會有兩條bands : 一條在44kD是我的目標蛋白 : 一條在17kD不知是啥鬼 : 這兩條band染色結果是差不多粗 : 可是做Western以Anti-His去認的話可發現17kD那條band非常非常地淡 : 怎麼看都不太可能是我的蛋白斷掉的片段 : 想請教的是... : 會不會是因為我在純化的過程imidazole濃度跳太多(20mM→250mM)？ : 我現在想試試看改成10mM、20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM : 那麼50mM、100mM、150mM、200mM這些的體積分別要加多少比較好？ : 謝謝！ --

※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.129.77.13