作者candy315 (沉澱)
看板Biotech
標題[問題] 關於real-time PCR的問題
時間Tue Mar 25 22:18:18 2008
※ [本文轉錄自 Bioindustry 看板]
作者: candy315 (沉澱) 看板: Bioindustry
標題: [問題] 關於real-time PCR的問題
時間: Tue Mar 25 22:09:47 2008
各位大大好，我是某大學的碩士生
我想請教關於real-time PCR的問題
大部份的實驗...都會用RNA轉cDNA然後再做real-time PCR
但我的template是genomic DNA
也有聽說genomic DNA的real-time比較不好做..
然後，一個大問題來了
我們老闆說，primer的量通常是總體積的1/10左右
所以我先用一般PCR在測試primer時，我是用5uM的primer，然後每管取2.5ul
(total volumn為25ul)
但做real-time時，因為我陰錯陽差的失誤
一直以來，我都是用5um的primer，然後每管加0.25ul
(total volumn亦為25ul)
我想請問大家，有人用過這麼少量的primer嗎??
因為我的實驗其實已經快結束了...如果我之前的primer量真的加的太少，
那我可能所有實驗要重做了....orz
所以我想請問各位有經驗的大大，有人也是和我一樣，用類似的量做real-time PCR的嗎
PS，我用的kit是 SYBR的kit
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◆ From: 203.64.80.19
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◆ From: 203.64.80.19
1F：推 aggaci:250 nM 很正常的濃度，我倒是建議你別取0.25 ul那麼小的體 03/25 22:30
2F：→ aggaci:積。稀釋10倍取2.5ul比較準確 03/25 22:31
3F：推 crypupa:不太正常吧? primer final conc是50nM 之前測過primer濃度 03/25 22:35
4F：→ candy315:謝謝A大給我的答案..我是把SYBR和primer配cooktail， 03/25 22:36
5F：→ candy315:所以其實沒有取小體積的問題^^，不知道A大手上有沒有ref 03/25 22:37
6F：→ candy315:也是primer加250nM左右的...我想拿來說服老闆.. 03/25 22:37
7F：→ crypupa:好像至少都要超過100nM CT才會穩定 不過做的是普通的DNA 03/25 22:37
8F：推 aggaci:J Clin Microbiol. 2004 July; 42(7): 3281–3283. 03/25 22:41
9F：推 crypupa:不過全部重做之前 可以先把primer濃度做序列稀釋跑跑看 03/25 22:41
10F：→ candy315:不好意思，我算了一下..C大算的好像才是對的 03/25 22:44
11F：→ candy315:看來我的primer好像真的加的過少....orz 03/25 22:44
12F：推 crypupa:如果沒影響就不用重作啦 03/25 22:46
13F：推 zoom8080:你再做一次比看看就知道啦~~ 03/25 23:23
14F：推 xareelee:測100~500nM不同的primer濃度 每50nM為區間 找CT低的用 03/25 23:27
15F：推 meiosisLin:(5*0.25/25)x1000 = 50nM 他的濃度是 50 nM沒錯 03/25 23:43
16F：推 meiosisLin:在ABI的建議中是100~300 nm不過如果對比出來OK就算了吧 03/25 23:48
17F：→ meiosisLin:Realtime的東西好貴啊～～～(今天又化了好幾萬 >_<) 03/25 23:49
18F：推 soda0:可以先看melting curve看跑出來的螢光是不是正確的~ 03/28 11:00
19F：→ soda0:real-time的東西很貴~確認好有需要在重做吧~ 03/28 11:02