作者candy315 (沉淀)
看板Biotech
标题[问题] 关於real-time PCR的问题
时间Tue Mar 25 22:18:18 2008
※ [本文转录自 Bioindustry 看板]
作者: candy315 (沉淀) 看板: Bioindustry
标题: [问题] 关於real-time PCR的问题
时间: Tue Mar 25 22:09:47 2008
各位大大好，我是某大学的硕士生
我想请教关於real-time PCR的问题
大部份的实验...都会用RNA转cDNA然後再做real-time PCR
但我的template是genomic DNA
也有听说genomic DNA的real-time比较不好做..
然後，一个大问题来了
我们老板说，primer的量通常是总体积的1/10左右
所以我先用一般PCR在测试primer时，我是用5uM的primer，然後每管取2.5ul
(total volumn为25ul)
但做real-time时，因为我阴错阳差的失误
一直以来，我都是用5um的primer，然後每管加0.25ul
(total volumn亦为25ul)
我想请问大家，有人用过这麽少量的primer吗??
因为我的实验其实已经快结束了...如果我之前的primer量真的加的太少，
那我可能所有实验要重做了....orz
所以我想请问各位有经验的大大，有人也是和我一样，用类似的量做real-time PCR的吗
PS，我用的kit是 SYBR的kit
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◆ From: 203.64.80.19
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◆ From: 203.64.80.19
1F：推 aggaci:250 nM 很正常的浓度，我倒是建议你别取0.25 ul那麽小的体 03/25 22:30
2F：→ aggaci:积。稀释10倍取2.5ul比较准确 03/25 22:31
3F：推 crypupa:不太正常吧? primer final conc是50nM 之前测过primer浓度 03/25 22:35
4F：→ candy315:谢谢A大给我的答案..我是把SYBR和primer配cooktail， 03/25 22:36
5F：→ candy315:所以其实没有取小体积的问题^^，不知道A大手上有没有ref 03/25 22:37
6F：→ candy315:也是primer加250nM左右的...我想拿来说服老板.. 03/25 22:37
7F：→ crypupa:好像至少都要超过100nM CT才会稳定 不过做的是普通的DNA 03/25 22:37
8F：推 aggaci:J Clin Microbiol. 2004 July; 42(7): 3281–3283. 03/25 22:41
9F：推 crypupa:不过全部重做之前 可以先把primer浓度做序列稀释跑跑看 03/25 22:41
10F：→ candy315:不好意思，我算了一下..C大算的好像才是对的 03/25 22:44
11F：→ candy315:看来我的primer好像真的加的过少....orz 03/25 22:44
12F：推 crypupa:如果没影响就不用重作啦 03/25 22:46
13F：推 zoom8080:你再做一次比看看就知道啦~~ 03/25 23:23
14F：推 xareelee:测100~500nM不同的primer浓度 每50nM为区间 找CT低的用 03/25 23:27
15F：推 meiosisLin:(5*0.25/25)x1000 = 50nM 他的浓度是 50 nM没错 03/25 23:43
16F：推 meiosisLin:在ABI的建议中是100~300 nm不过如果对比出来OK就算了吧 03/25 23:48
17F：→ meiosisLin:Realtime的东西好贵啊～～～(今天又化了好几万 >_<) 03/25 23:49
18F：推 soda0:可以先看melting curve看跑出来的萤光是不是正确的~ 03/28 11:00
19F：→ soda0:real-time的东西很贵~确认好有需要在重做吧~ 03/28 11:02