作者imeating (sensitive)
看板Biotech
標題Re: [討論] cloning
時間Wed Mar 26 05:07:26 2008
※ 引述《lblackpig (小黑豬)》之銘言：
: 我使用PCR的方式將目標基因p出來，將PCR product由gel純化出來，再將其與T voector
: 進行ligate，並進行transform。結果可以長出蠻多的colony。接下來想要將其clone到
: pEGFP-N1，使用enzyme將T vector上的gene切下並elute出來，同時也使用相同的enzyme
: 切pEGFP-N1(不過可能兩個切點太近，只有約4-50 bp，所以gel上並看不出被切下來的
: band，也不太確定有沒有切開），將兩者放在一起liagte，之後進行transform。但是
: 長出來的colony非常少，或者完全沒有，不管我的基因是600bp或1600bp，都是這樣，各
: 位有沒有任何看法？為何這樣的liagtion似乎好像效率不高？
1.就我個人經驗，PCR product做TA cloning時，
這樣的ligation成功機率非常高，
非常容易得到多且正確的colonies。
但其他的steaky end ligation很少有如此高的成功率。
所以你後來得到的colony數目不多實屬正常現象。
不過我也不知道為什麼TA ligation的效率會比
其他steaky end ligation來得高，
有沒有高手解答一下？
2.請問原po有沒有注意vector和insert之間的比例？
一般來說，
insert的量必須遠高過vector，
效率才會好。
不過重點是，
其實只長一顆也沒關係呀，
有中就好!!
3.檢驗pEGFP-N1有無被切開，
可以跑膠比較切以前和切以後的plasmid大小，
雖然被切下的部分只有40-50bp應該看不到，
但是如果環形的plasmid有被切成線形，
跑膠後大小會和原本的環形差很多。
4.不知道你有沒有做vector only和insert only的control?
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◆ From: 218.168.77.193
1F：→ imeating:不過我想你的pEGFP應該有切動吧?如果沒有切動 03/26 05:08
2F：→ imeating:幾乎可以當作是在transform plasmid 03/26 05:09
3F：→ imeating:這樣的話應該會得到超多colony XD 03/26 05:10
4F：推 lblackpig:非常感謝，我再加多一點insert看看 03/28 19:45