作者imeating (sensitive)
看板Biotech
标题Re: [讨论] cloning
时间Wed Mar 26 05:07:26 2008
※ 引述《lblackpig (小黑猪)》之铭言：
: 我使用PCR的方式将目标基因p出来，将PCR product由gel纯化出来，再将其与T voector
: 进行ligate，并进行transform。结果可以长出蛮多的colony。接下来想要将其clone到
: pEGFP-N1，使用enzyme将T vector上的gene切下并elute出来，同时也使用相同的enzyme
: 切pEGFP-N1(不过可能两个切点太近，只有约4-50 bp，所以gel上并看不出被切下来的
: band，也不太确定有没有切开），将两者放在一起liagte，之後进行transform。但是
: 长出来的colony非常少，或者完全没有，不管我的基因是600bp或1600bp，都是这样，各
: 位有没有任何看法？为何这样的liagtion似乎好像效率不高？
1.就我个人经验，PCR product做TA cloning时，
这样的ligation成功机率非常高，
非常容易得到多且正确的colonies。
但其他的steaky end ligation很少有如此高的成功率。
所以你後来得到的colony数目不多实属正常现象。
不过我也不知道为什麽TA ligation的效率会比
其他steaky end ligation来得高，
有没有高手解答一下？
2.请问原po有没有注意vector和insert之间的比例？
一般来说，
insert的量必须远高过vector，
效率才会好。
不过重点是，
其实只长一颗也没关系呀，
有中就好!!
3.检验pEGFP-N1有无被切开，
可以跑胶比较切以前和切以後的plasmid大小，
虽然被切下的部分只有40-50bp应该看不到，
但是如果环形的plasmid有被切成线形，
跑胶後大小会和原本的环形差很多。
4.不知道你有没有做vector only和insert only的control?
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◆ From: 218.168.77.193
1F：→ imeating:不过我想你的pEGFP应该有切动吧?如果没有切动 03/26 05:08
2F：→ imeating:几乎可以当作是在transform plasmid 03/26 05:09
3F：→ imeating:这样的话应该会得到超多colony XD 03/26 05:10
4F：推 lblackpig:非常感谢，我再加多一点insert看看 03/28 19:45