※ 引述《pop6234 (表面的和平)》之銘言： : 我的insert大概是1400bp : vector是pAS2-1 (Clontech) : 切單刀 : 所以有用CIP處理vector : 切完酵素之後跑電泳切膠 : gel extraction之後 : 再做ligation : 16度C overnight : 因為我的insert量很少 : 所以我insert跟vector的ligation比例用 : 3:1 3:0.5 5:0.5 : 還有做vector的(切完酵素之後再ligation) : 可是 : transform之後 : 盤上一顆也沒長 : vector only的也沒長... : 本來老闆覺得是我技術不好 : transform有問題 : 所以我上次有多做一組沒有切過酵素的vector : 那次就那盤沒切接過的有長而已 那這組positive control長出來的colony數有合格嗎? : 如果說是我ligation的比例不好之類的 : 我都可以接受 : 可是 : 連vector only的都沒長 : 讓我真的不知道該怎麼改我的實驗 : 想請教大家連vector only 的都沒長有可能是什麼原因? vector是人家給的吧? 凡是自己沒有確認過的東西都先別相信是真的 : buffer之類的都是公用的 : 別人的clone都有長 : 就我的長不出來... 這問題常出現在剛入實驗室的新人身上 先不就接進去的這片段是否有細胞毒性 (就算是要順利表現活性的機率也超低,但我就衰到碰過) 小弟我覺得要先檢討你的transformation efficiency 這包括了compotent cell置備 (貴實驗室若是$$多買現成heat shock的效果也絕不會比用eletroporation的好) 另外送入DNA的質與量是否足夠 我個人覺得，拿不到clone多和個人手法有關....... -- 蓋圖書館超痛苦 --

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