※ 引述《pop6234 (表面的和平)》之铭言： : 我的insert大概是1400bp : vector是pAS2-1 (Clontech) : 切单刀 : 所以有用CIP处理vector : 切完酵素之後跑电泳切胶 : gel extraction之後 : 再做ligation : 16度C overnight : 因为我的insert量很少 : 所以我insert跟vector的ligation比例用 : 3:1 3:0.5 5:0.5 : 还有做vector的(切完酵素之後再ligation) : 可是 : transform之後 : 盘上一颗也没长 : vector only的也没长... : 本来老板觉得是我技术不好 : transform有问题 : 所以我上次有多做一组没有切过酵素的vector : 那次就那盘没切接过的有长而已 那这组positive control长出来的colony数有合格吗? : 如果说是我ligation的比例不好之类的 : 我都可以接受 : 可是 : 连vector only的都没长 : 让我真的不知道该怎麽改我的实验 : 想请教大家连vector only 的都没长有可能是什麽原因? vector是人家给的吧? 凡是自己没有确认过的东西都先别相信是真的 : buffer之类的都是公用的 : 别人的clone都有长 : 就我的长不出来... 这问题常出现在刚入实验室的新人身上 先不就接进去的这片段是否有细胞毒性 (就算是要顺利表现活性的机率也超低,但我就衰到碰过) 小弟我觉得要先检讨你的transformation efficiency 这包括了compotent cell置备 (贵实验室若是$$多买现成heat shock的效果也绝不会比用eletroporation的好) 另外送入DNA的质与量是否足够 我个人觉得，拿不到clone多和个人手法有关....... -- 盖图书馆超痛苦 --

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