最近在做一个cloning，做了一个多月已经想不出别的办法了，特来求教 vector length: 4.1kb （pAcGFP1-1） insert length: 2.9kb （PCR product as with restriction site at both ends, and several bp extension） 利用sticky end（HindIII & SacII）做为insert接入vector的切位 在ligation之前，先各以Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol（以下简称PCI）纯化 做完double digest（两个RE都是Promega的）之後直接跑胶做gel extraction 然後就测定浓度并做ligation（by Promega T4 DNA ligase） 曾经测试过的ligation reaction condition包括： 4℃ overnight、16℃ overnight、Room Temp. for 2hrs and 4℃ or 16℃ overnight、 Room Temp. overnight（以上皆为代理Promega的劲因公司提供的建议） 曾经试过的vector：insert molar ratio包括2：1、1：1、1：2、1：3 （total DNA控制在不到100ng） （附注：後来拿ligation产物跑电泳，皆发现一块大於10kb的smear区域， 光拿pAcGFP1-1跑不出这种长度） 曾经使用过的competent cell包括益生的ECOS101及 （每个reaction皆将所有ligation product全部加入一管competent cell中） Stratagene的XL-10 Gold ultracompetent cell （每个reaction取20ug competent cell，加入1ul的ligation product） （由於这型competent cell对加热温度及时间较为注重， 故而前段icebath及heatshock的部分放在0.2ml PCR tube内进行， 之後incubation再转移到1.5ml eppendorf tube中并加入培养液） 在LB agar plate上使用的抗生素及浓度为Kanamycin 50ug/ml 这样子做了好几次都做不出来 请问有做过这个质体cloning的先进或是做过这麽长cloning的先进 我还有哪些实验细节可以改进的，谢谢 -- ◎ Origin: 中央松涛站□bbs.csie.ncu.edu.tw From: 104.211.192.210.dynamic.ttn.n