【问题】： 如何找出PRIMER与template的condition 【问题起因】： 现在我有一组sample做为control，在这组control理论上是不会被primer 黏上，也就是应该 "不会有BAND" 出现 但跑出来结果有BAND产生，所以现在想法在於condition问题 以下这想法不确定正不正确 "只要condition合适，不论primer与template是不是在序列上有没有match 有可能有"一定机率"做出产物" 也就是比如anneling温度极低，使某CYCLE PCR不小心黏上做出东西 那麽这样的错误就会被放大 (也就是该错误变成template，然後做出产物) 基於这样的想法 (不确定这想法对不对) 要求证，想透过是否有软体能计算 primer跟template在怎样的条件下会match并做出primer 我有试过用mac vector，但似乎只会跟你讲说 这primer不会match之类 (也有可能我操作不熟，或有我不知的方法) 而我要求的是在怎样他们才会match，不论条件多极端 【个人看法】： 主要因为我实验的PCR是在非常低的anneling温度，想知道这样条件是否就是问题 而同组control不同次的实验 (一样sample一样condition，差别只在先後) 却有不同的结果。 再尽力避免人为失误之下，考虑是污染被放大的情况 也就是不正常环境下的match 感谢各位 --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 140.120.130.105 谢谢提供连结 我会试试看 V大提到梯度是指 梯度PCR吗?? 即比如annel温度 44 44.5 45 45.5 46 46.5 ..... (同样的solution，但不同anneal teamp) 这样同时下去跑 之後跑GEL看BAND? 可我目前遇到 同样的condition，却前後结果不一 比如说 anneal temp = 45c 第一次出现band (在不该出现band的control) 第二次没有band .. . . 因为如果问题在这里 推测应该是primer稳定性的问题 即专一性+tm太低 目前是打算再一次回头check所有condition 确定其中没有受到污染 另外有版友提到关於我这种 non-target control 问题会很多 排除污染之後可能会来考虑这一步 非常感谢你 ※ 编辑: travelmat 来自: 114.33.54.112 (02/25 10:58) ※ 编辑: travelmat 来自: 114.33.54.112 (02/25 10:59) 可我就是稿不懂为甚麽.... 比如其中一次TEST 我一次做两批 control+实验组 结果跑出来结果两组不一样(neg control组) ※ 编辑: travelmat 来自: 114.33.54.99 (02/25 21:17) 所以我才会倾向PRIMER专一性稳定性低 ※ 编辑: travelmat 来自: 114.33.54.99 (02/25 21:18)