※ 引述《a64toto (我)》之铭言： : ※ [本文转录自 Biology 看板] : 作者: a64toto (我) 看板: Biology : 标题: [问题] 再请问一下ligation的问题 : 时间: Sat Apr 29 20:24:52 2006 : 之前在版上有看过一些相关的问题 : 可是还是有一些疑问想请教一下 : 我是使用Q牌的agarose gel extraction kit : 在使用前与使用後都有跑agarose确认有band出来 : 可是在transform都没有coloy长出来(接到pET 23a vector) : 可是接到T vector的都有长出blue colony 蓝白斑筛选,蓝色是空载体,白色才是有插入片断的 : 所以应该不是transform出问题罗 : 那要check ligation有没有问题的话 : 好像positive control是放已经切好的vector是吗?这样一定会长出colony吗? : 还是我搞错啦 : 还有如果拿10 ul的ligation mixture(已经16度O/N)直接跑agarose gel : 这样能看得出来有没有接起来吗? 看不出来的 连接效率很低的,所以连上的环状质粒不可能看到 : 最後我染agarose gel的dye是SYBR不是EtBR,请问这样会对ligation有影响吗? 和你一样的问题我也遇到过 後来改了一些条件就做出来了 一是，pET系列载体都是低拷贝的，得到的vector通常浓度较低，连接时要稍多加一些 二是，同样是由于低拷贝的原因，培养基（无论固体还是液体）里的抗生素要比平时减半 三是，在连pET系列载体时，T牌的ligase通常会比N牌的差蛮多 --

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