作者elderbear (暧昧不好不要暧昧)
看板Biotech
标题[问题] 大片段产物的 PCR
时间Tue May 2 15:46:03 2006
我是参考某篇 paper 的作法
产物从500bp~3kbp 都有
所使用的enzyme是 ampliTaq Gold polymerase
PCR program
95度 10min
95度 1min ___
55度 2min |45cycles
72度 2min ___|
72度 7min
所使用的 primer 经过软体测试
Tm值大概是 57~60
我有跑 55 跟 60 度的 (annealing temp)
结果长片段的(1kbp以上)出不来或是杂band(而且还没期望出现的band)
短片段的有些有出来有些出不来(或有杂band)
看文章说大片段的可以考虑用 pfu
我就去弄来用用看
所使用的 program 是
95度 5min
95度 1min ___
55度 2min |45cycles
72度 2min ___|
72度 7min
结果原本做出单一短片段的反应做出了杂 band(只挑一个出来对照)
大片段的产物都很奇怪(只有 8x~3xx bp)
因为我不太了解 pfu polymerase 的特性
不知道 program 是不是不适合
接下来可能考虑将 annealing 时间改短至 1min
extension 时间拉长到 3min
想请问各位的是有用过 pfu 或做过大片段产物的人
你们所使用的 program (如果是用 pfu) 大概是怎样的呢?
如果不是用 pfu...那是用什麽呢?
还有我是不是忽略了什麽可以调整的地方?
提醒我一下
谢谢~
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.74.11
1F：推 ROKEE:不同的Taq主要区别在於是由不同物种而来 05/02 19:01
2F：→ ROKEE:一般DNAP合成DNA的速率大概30bp/sec，自己估算一下罗^^" 05/02 19:02
3F：推 absentee:pfu的反应时间说明书上有写 你可以去找找看 05/02 20:07
4F：推 dorphilvet:我们的做法比较保守，以taq1分做1000bp来算，你可以 05/03 00:39