作者aggaci (有气质的台客)
看板Biotech
标题Re: [问题] Ligation失败(已看过)
时间Thu May 11 13:11:51 2006
※ 引述《ctlee (宁静小城)》之铭言：
: 请问各位高手
: 小弟现在要将3kb的PCR product接到一6.4kb的vector的Bgl II上
: 我先PCR amplify我的fragment
: 纯化後用Bgl II切再gel purify以去除nonspecific products
: 至於vector, 我用Bgl II 切完纯化後用CIAP做dephosphorylation
: Ligation的时候insert:vector大约维持在5:1的比例
: 14 C overnight之後 transform到DH5alpha competent cells
: 奇怪的是,我的control(无insert)没有任何colony
: 有insert的ligation 做transformation出来所得的clone全是self-ligation
: 我实在无法解释这个结果,难道insert会促进self-ligation吗
: clone这个fragment好几个月了都没什麽进展,拜托各位帮忙了
pPCR product直接切可以
以BglII来说，再primer设计上面得多延伸3个nucleotide才会比较好切
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http://0rz.net/da0PG 我的相簿....
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.100.165
1F：推 shaline:推~可以参考NEB catalog上有说明BglII切点多延伸GA或TC， 05/11 13:47
2F：→ shaline:enzyme作用20小时可达>90% cleavage 05/11 13:49
3F：推 yoknowme:也可以先接blunt end, 成功後送sequence看primer有没有做 05/11 23:02
4F：→ yoknowme:错, 我有一次因为厂商primer做错 而白花了好几个月 05/11 23:03
5F：推 chiasaiqueen:我也是。primer一堆deletion，做TA後才发现! 05/12 01:59
6F：推 andrew4728:推primers出包,真的超无言 05/13 23:17
7F：推 pj0611:可以问是哪几家厂商嘛?...很怕我也.... 05/15 09:57