※ 引述《[email protected] (Girls, be ambitious)》之铭言： : 我的细胞会表现EGFP 因为我染PI(propidium iodide)想要看cell cycle : 希望看得是有表现EGFP的细胞 : 我原本是照PI的protocol利用EtOH固定 结果跑flow时完全侦测不到EGFP : 跟学长讨论的结论是可能酒精会影响EGFP表现 : 想问问各位前辈们 我要做PI染色可以用paraformaldehyde固定吗？ EGFP expression通常在细胞被固定之後 就看不到了 如果你的GFP在被PFA固定後 还可以被侦测到 那你倒可以试试 PI staining本身只要细胞被permeablize PI可以进入细胞核染到DNA 我想如何固定细胞 应该不是最大的问题 我的建议是用EGFP antibody做intracellular staining 至於如何将PI staining和intracellular staining结合在一起 最常被使用的范例就是 anti-BrdU和PI的例子 我稍微google了protocol (可以看看他们如何固定细胞) 贴一个范例给你参考 http://www.cancer.wisc.edu/clinician/flow/protocol-brdpi.html : 另外我想再问关於flow的问题 : 我们学校那台flow共有三个滤片 FL1 FL2 FL3 : 看EGFP是用FL1 我查了一下emission在508nm : 看PI 用FL3 PI emission在620nm 但是PI + DNA 约在514nm : 那这两个会不会影响到呢？ 需不需要做互补？ : 很多问题.......麻烦大家了 PI可以被FL2 and FL3 detected somehow 也会影响FL1 (反之亦然) 但是请注意 EGFP/antiboy萤光的测定是Log mode PI的测定则是用linear mode 需要注意的是FL2 channel(linear mode) 侦测到的FL1 (log mode) 确定FL1不会干扰你cell cycle的判读 你可以做以下control 1. mouse spleenocytes with PI staining only 这是很好的cell cycle profile control 因为spleenocyte每一个stage的细胞都有 2. FITC/GFP only-> gate FITC/GFP+ cells-> display at FL2-A (linear mode) 看看peak 会出现在哪里 应该不会干扰到才是 -- 如果我是你 我会想办法sort EGFP+ and EGFP- cells 之後再固定起来看PI --

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