※ 引述《ssuny (黑夜中的黑猫)》之铭言： : 小弟目前正在做质体的构筑 : 要利用double digest的方法将insert从构筑好的plasmid(pGEM-T easy)上切下来 : 示意图如下 : vector insert vector : ▅▅▅▅▅│▅▅▅▅▅▅│▅│▅▅▅▅ : NdeI XhoI NdeI : 我insert是具有NdeI以及XhoI切位 : 而在pGEM上也有一个NdeI的切位 : 因此我先用XhoI切 : 以phenol/chloroform回收 : 再以NdeI切第二次 : 可是目前遇到的问题就是.. "第二刀怎麽切都切不动" : 切位确定是没问题的 : 可是就是不知道为什麽怎麽做都做不出来 : 想请问一下各位版友知道这是为什麽吗? : 谢谢 我跟你有一样的问题！！ 我的insert 大概1000bp, 我用的系统是 pET-15B (5708bp),我用的也是double digestion , NdeI & XhoI, 我做ligation把他接进去了， 然後我先用PCR做check, 有夹出我要的片段，然後我就在有insert 的plasmid 上 只切一刀试试看， 结果出来的片段是六千多bp, 也是符合我的预期， 但问题来了，在只有NdeI or XhoI 的情况之下，我只选用一种限制脢去切都切的动， 但是，一旦用两种限制脢同时切， 却就只看到切一刀的样子， 我那个insert完全没有被切下来，我用的温度啊 buffer 也完全按照 NEB建议 怎麽会这样呢？ 真希望有人可以给我们建议！ 谢谢 --

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