作者aggaci (有气质的台客)
看板Biotech
标题Re: 请问大片段的RT-PCR
时间Sat Jun 10 22:33:44 2006
※ 引述《aggaci (有气质的台客)》之铭言：
请问一下 最近想钓几个基因出来作表现
3个基因PCR出来的片段大小约为1.5 kb
本来用construct的primer去夹 没夹到(位置不对，差太多)
後来再往外设计primer想做nested PCR
怪的是...那个位置也没有我想要的band!
这....看了一下他们序列，发现GC比例还不少
明天会加DMSO或formamide试试看..............
想请教大家，有没有什麽原因会导致PCR没有产物?
(是primer dimer的原因吗?发现我的primer dimer似乎还不少)
以下是我的条件
95度 30s
60度 30s
72度 100s
35 cycle
p.s
1.cDNA quality不好的原因已去除，因为这是别人给我的cDNA
他已经检查过了
2.我非常确定这个细胞有表现这几个基因
唉 第一次做RT-PCR感受到这麽强大的无力感
难怪有人说RT-PCR是最困难的技术，因为他太简单了
简单到发生问题不知道问题出在哪
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http://0rz.net/da0PG 我的相簿....
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◆ From: 140.114.100.165
※ 编辑: aggaci 来自: 140.114.100.165 (06/08 01:08)
1F：推 meiosisLin:你的CG值有多高？and DMSO加的比率？ 06/08 02:24
2个60%左右，一个70%
算高了吧.............
这几天一直PCR P到快疯了
其实我有点怀疑
作RT时会不会根本没做出来...
毕竟RT的作用温度为42度(我用promega的MMLV)
形成二及结构的机会太高
2F：推 oxoox:如果你的gc值高 应该把前面两个时间加长到一分钟以上 06/08 21:52
唉 做过了，还是没用
我看去借个betaine来试试好了.........冏oz
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◆ From: 140.114.100.165
3F：推 meiosisLin:我做过CG值64%的....DMSO加到7.5~10%..正常值不超过5% 06/11 03:00
4F：→ meiosisLin:另外...annealing 温度往下降到58~54之间试试看... 06/11 03:01
5F：→ meiosisLin:前两段时间加到一分钟..... 06/11 03:02
6F：→ meiosisLin:PS:原始ＤＮＡ序列CG值高家ＤＭＳＯ试试看..两端primer 06/11 03:03
7F：→ meiosisLin:ＧＣ值过高也可以用此方试试是看.... 06/11 03:04
8F：推 vixen:RT那个步骤往往是关键所在. 06/13 04:45
9F：推 aggaci:是阿，所以我刚订了thermoscript，可以在高温做RT... 06/13 10:00
10F：推 zanhna:RT primer的选择也会有差异' 06/13 19:25