※ 引述《wensing (潜力股)》之铭言： : 各位先进，小弟初次接触用E. coli表现蛋白！ : 我采用的是M15[pREP4]与pQE1，37℃，150rpm，1mMIPTG(最终) : 我的蛋白质是20KDa : 现在我是将诱导後(4hr)的菌液，取 100μL 离心 去上清液 : 直接再加入sample buffer (β-me)(有加热处理)，然後直接跑SDS电泳。 : 可是在电泳图上看不到我的产物位置 (我有对照组) : 但我有观察well到上有一层薄薄的白色沉淀物 : 我想问： : 1. 那一层白色的东西是什麽？ 会是我的产物(都变成inclusion body)吗？ : 2. inclusion body 加入sample buffer处理後直接跑胶片 : 这样子会看到得band吗？也就是sds可完全部破坏inclusion body？ : 3. M15[pREP4]与质体pQE1均会产生抑制子，1mM IPTG这样子浓度够吗？ : 还是太多？(我是照着手册上培养方式)。 : 4. 若万一都是inclusion body，是否我要改变培养温度(低温培养)会比较好？ : 烦请各位先进指点一下！ : 谢谢！ 分享一下我的经验 表现蛋白的部份应该是都差不多 但是在跑胶时 我会先离心(把菌离下来) 然後加8M urea去破菌 (回溶菌泥後有可能澄清也有可能浑浊 视菌量而定) 加热到90度 10至20分钟 跑胶 可以看出有没有表现 但是不能知道是否是inclusion body 白白的东西应该是菌的残骸 你sample buffer中有什麽成分? 如果只是SDS应该不足以完全破坏inclusion body (上面这句话是我据经验推测 有错请纠正 感谢~~^^") 问题3的话 因为我不熟 所以不好意思乱盖 XD 形成inclusion body原因很多 你可以试试不同状况 如: OD600=0.4 or 0.6 or 1 去induction IPTG浓度: 1mM 0.5mM 或 0.1mM induction时的温度: 37度 30度 20度 induction时间: 4hr...等 通常配合温度调整 我也是新手 欢迎再讨论 祝你顺利唷~ --

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