※ 引述《tsen (做实验做到快窒息@.@)》之铭言： : 我使用的primer是在405bp的位置 : 但是跑完胶之後 用UV照射後却不见band出现 : 我同时间订了三对primer其他两对都做的出来 : 唯独这对很奇怪 : po一下这对primer的资料 : Primer F：35mer, GC content：51%, Tm为66.8度 : Primer R：26mer, GC content：54%, Tm为61.1度 : 跑完之後是连杂band都没有 好歹也出现个杂band阿 : 完全没有东西让人没有头绪阿 况且其他两对都做的出来阿 : 会是primer F太长了嘛? : 麻烦各位大师帮我看一下阿>"< 感谢!!! =====>if 去除掉太一般的技术问题, ex: 某管PCR漏加dNTP, primer漏加一根... (这些都要请原po注意到) 预测的PCR product size是405 bp, 应该不会有做不出来的问题 真的如你所言, 同样的cDNA(我指一模一样的同一批, 同一管)大家都做的出来, 只有这组primer做不出来的话.... 如果问题在primer上 最可能情况有如下二种: 1. 请check一下primer sequence的最後一个mer, 是不刚好在那个gene的SNP处 个人经验是primer 的最後一个nt如果mismatch, 是不可能做得出来的 上NCBI database查一下吧 2. 没看到你的primer sequence, 我不知道你这组primer 是不是self-dimer太严重, if so, 降annealing temp不一定做得出来 个人建议於PCR mixture中加入DMSO, 帮忙把2级结构打开 记得DMSO conc. <5% 如果问题在cDNA上 要注意那个gene是inducible or constitutive expression?? 是不是induce得不好?? check一下药过期了没 呼... 我还是去做实验好了, 打字手真酸... --

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