作者aggaci (有气质的台客)
看板Biotech
标题Re: [问题] 请问大家 有关分离核质prorein的方法
时间Mon Jul 17 21:38:30 2006
※ 引述《aggaci (有气质的台客)》之铭言：
: ※ 引述《[email protected] (可爱女孩)》之铭言：
: : 可以跟大大要一下protocal吗
: : 我也再做这部份实验 但是一直分不乾净 谢谢
: : 信箱是 [email protected]
: 抽核蛋白
: 1.细胞以cold PBS wash
: 2.离心 4000rpm/5min at 4℃
: 3.以extraction buffer将细胞打散
: *extraction buffer
: [10 mM KCl、20 mM HEPES(pH 7.9)、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、20% glycerol、
: 0.5 mM DTT、PMSF、leupeptin、aprotinin]
: 4. 置冰上15分钟
: 5. 以针筒+针头『吸放』cell藉以打破细胞
: 6. 离心14000 rpm/1min
: 7. 去除上清液(上清液为cytosolic protein)
: 8. 沉淀物以nuclear extraction buffer打散
: ﹡nuclear extraction buffer
: [500 mM KCl、20 mM HEPES(pH 7.9)、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、10% glycerol、
: 0.5 mM DTT、PMSF、leupeptin、aprotinin]
: 9. vortex 最高转速15sec/10min 3~6次，期间至於冰上
: 10. 14000 rpm/5 min at 4℃，上清液为nuclear extract
: 11.测蛋白质浓度，分装存放於-80冰箱
: 这个方法会有些抽到cytosolic protein
: 有以tubulin为negative control做过测试
: 但是跟cytosolic part的tubulin比起来差很多
忘了说，针头size最好用25g的....
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