作者asplash (我好想你~)
看板Biotech
标题Re: [问题] RT-PCR for Full lenth cDNA
时间Tue Jul 18 20:13:58 2006
※ 引述《bluestanley (好想吃苹果...)》之铭言：
: 最近要P约3000bps的一段full lenth cDNA
: 因为primer没得选择只能用ORF的头尾两段
: 厂商送来的Primer Tm值差了约5度左右 (61度&56度 G/C约50%)
: 但是一直P不出来 快要发疯了
: 想请问一下各位高手 P大片段DNA时所用的condition是怎样呢?
: 或者有什麽要注意的地方呢?
: 谢谢大家指教 ^^
第一个 PRIMER要注意你的TM可以试看看用58度~~
G/C越高 越难P阿...还有你的3000bp的片段..
extension时间需要看你的Taq能力唷...普通的taq差不多也要120秒..
还有建议你!!这麽长的片段最好用好点的Taq 有proofreading的比较好..
不然错误很多的..定序回来会想哭吧!!
在不然如果你知道sequence的话..可以分前後段P..然後中间至少有100bp
overlapping 前後在接起来也可以得到全长!!
另外..一开始95度的分开两股时间久.一点..片段好长!!!
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