※ 引述《threestars (等待)》之铭言： : ※ 引述《linker0726 (试着独立)》之铭言： : : 今天压片子的时候，perk的讯号很强..压了5秒就很黑了 : : 但是erk的压了20分钟完全没有东西... : : 请问是哪里出错了....之前有成功压出来过... : : erk的浓度是1:1000... : : 感谢 : 最近一直在押 ERK : 你问的是protein的ERK1/2 还是phospho-ERK : ERK量比较少本来是要压久一点 但20分钟好像太久了 : 你的ECL有稀释吗？ : ERK 1：1000算满浓的 如果还出不来 你可能要检查一下是不是1抗或2抗坏掉 : 抗体加入blocking buffer时 buffer温度太高也不行 : 如果是phospho-ERK 又比ERK弱 : 我之前ERK和phospho-ERK 都用Santa Cruz : ERK还OK phospho-ERK有够糟糕 压了两个月 看的到band : 但杂band一堆 要不就是背景直很脏 : 就像之前版友讲的 一样状况 圣诞牌很糟糕 : 跟老板讲又不太相信 一直叫我试条件 : 直到有其他老师跟他讲说圣诞牌的会这样他才相信 : （好像是跟抗体不同批号有时候会出现特好或特坏的状况） : 最近换cell signaling 一下就出来拉 漂漂亮亮 嗯嗯...其实我是新手..这是第二次自己跑western blot.. 请问一些很基本的问题..我怕我是不是记错了... ERK还是phospho-ERK的讯号哪个比较强阿...我有点搞混了...只记得压第一片时萤光很 明显.压了一秒BAND就很漂亮了..我记得这个是ERK吧..(也就是说我第一篇文打错了..) 应该是phospho-ERK压不出来 (这个比较难出来???) 另外.昨天有跟老师讨论，他说有可能是我加2抗的时候，用MILK当稀释关系... 可是之前学长姐说加MILK会让背景比较乾净... 於是我昨天跑今天压了一片..可是不用MILK稀释2抗..改用PBS 1X稀释... 是有跑出点东西了..但杂BAND还满多的...还跑出来不是预期的BAND Orz 等会再问看看我们家是不是用圣诞牌的 = = 好像是...不过在确定一次 因为之前有换过一次抗体..但压出来...band爆多的= = 几乎每个不同的kD都跑出来.. 专一性有点问题..就退掉了..所以现在我也不知道是用什麽牌子的 先在问看看罗... 还有..用PBS会不会干扰phospho-ERK阿? 都有磷酸.... 你都用什麽稀释阿?? --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 125.228.149.230