※ 引述《boblu (六百)》之铭言： > 一个跑sds page 有时会碰到的问题 > 以前都不是很在意 反正有时候碰到有时候不会 且 western 能染出要的东西就好了 > 但最近需要高品质的PAGE结果 > 而我花大精神做的 sample 却每每死在 SDS PAGE 这里 感觉很... :( > 我碰到的状况是 一条 lane 在某个很强的 band 的位置变成"微笑"状 > 微笑上面的 band 都很清楚 下面的就胡掉了 > 而且微笑的那个位置 整条 lane 的宽度会收缩 > 如果旁边有 maker 会很明显看到 marker 的宽度在同样的位置开始扩张 > 基本的想法是盐类太高或蛋白质浓度太高 > 但我这次碰到问题的样品是纯化出的蛋白质 也置换过 buffer > 盐类跟蛋白质浓度还有 pH 都还算一般 > 晚一点贴个图给大家看 图贴上了 http://photo.pchome.com.tw/boblupersonal/019/ 左边是原始影像 右边是处理过的影像 箭头是我想要取得的蛋白质 共有五条 lane 分别是 sample1 marker sample2 marker sample3 sample1 2 3 其实是一样的东西 是我试图纯化的蛋白质 溶在 protein A/G column 纯化抗体时用的 elute buffer + neutrolyze buffer （我是作了一个 antibody column 来纯化蛋白质） 用 10kD 的 ultra filter unit 去盐并浓缩 估计蛋白质浓缩五倍 buffer dilute 到 1/5 跑 7.5% 的 sds page staking 50V 15 min seperating 200V 跑到底(~40min) 然後 50V 100min transfer 到 membrane 上 染 coomassie blue 目的是要拿去作 N-terminal sequence sample 3 的 loading 量是 1 2 的1/5 看起来 loading 少是比较漂亮 可是 1. 总觉得没什的道理 浓缩的 sample 里面明明什麽东西都还是很少 2. loading 少 想看到的 band 就找不到了 3. 分子量大概五十以下还是很模糊 PS. 我做过好几次 只有一次跑出漂亮的结果 那次用的是10%的sds page 可是这种浓度下 我想要的蛋白质附近其他的 band 又分不太开 -- 莫非定律: 到了期末才会想起期初曾选了一门课却一直没去上 补充定律: 拿到成绩单才发现上了一学期的课忘了去考期末考 -- ※ Origin: 生命科学 BBS <bbs.life.nthu.edu.tw> ◆ From: ym71010.ym.edu.tw