您好： 非常感谢您能拨冗打了这份protocol 我想请问一下这个最後用test plasmid作测试时大约可达多高的效率呢？ 敝实验室也是利用这个方法 不过作出的效果惨不忍赌(本人是实验的新手，我们的protocol跟你的长得差不多) 还有想请教你进行heat shock是多少度几分钟呀 因为原始论文不推荐进行heat shock，对此我也有些疑惑故想问问 我们实验室是说，作这个只有两个要件 快 都是冷的不要回温 像您会分装好後先放在冰上30mins，再丢入N2中 这有什麽特别的效果吗？因为我们实验室是没有这样的，学长是越快分完，然後快快丢入 liquid N2中 还望先进能有所指教，非常谢谢您！ ※ 引述《enisx (嘁嘁窣窣)》之铭言： : 我常用的Protocol: (我大概每3-4个月会作一次) : 1.Day1: Incubate at 37度 on LB plate for 12-16hr. (From bacterial stock ; : JM109 or DH5alpha) : 2.Day2: Steak a single colony into 5ml of LB medium, then incubate at 37度 : for 12-16hr. : 3.Day3: Transfer 3ml of overnight culture into 200ml of LB, then incubate at : 37度 for addition 3hr or so.(OD600=0.375-0.4) : 4.Centrifuge 2500 rpm at 4度 for 10min, then discard the supernatant. : 5.Add 100ml of ice-cold 50mM CaCl2 (autoclaved) to cell pellet and : re-suspend cells completely. Place on ice for 30min. : 6.Centrifuge 2500rpm at 4度 for 10min, then discard the supernatant. : 7.Add 12ml of ice-cold TSS with 5% DMSO to cell pellet and re-suspend : cells completely. : 8.Make 200ul of aliquots and put on ice for 30min. Then, using liquid N2 to : freeze cell. : 9.Use 100ul of competent cells to perform transformation. : TSS: (Autoclaved; fresh prepared) : Stock final 150ml : PEG3350 10% 15g : MgSO4 1M 25mM 3.75ml : MgCl2 1M 25mM 3.75ml : Tryptone 1.5g : Yeast ext. 0.75g : NaCl 0.75g : ( 12ml TSS 中加入 600ul 原倍DMSO ) : ※ 引述《koele1984 (koele1984)》之铭言： : : 请问有人利用TSS(Transformation and Storage Solution : : for chemical transformation)来制备competent cell吗!? : : 我找到了2份的protocol : : solution的配法大同小异 : : 只不过我在test efficiency时 效果很差 : : 我想有几个原因 : : 1.我当初在加PEG的时候，经过autoclave後仍有一些没溶解 : : 2.有些protocol加完TSS後不用放在冰上20分钟，有些有要求 : : (我加完後就直接拿去-80冻了) : : 目前找到的就这几个问题 : : 请帮我看看.....Orz : : ps.我可以顺便要TSS的protocol吗!? : : 我想比较看看哪个比较好.... --

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