※ 引述《melodyrabbit (melody)》之铭言： : ※ 引述《CloudTear (照片能吃吗？口去～)》之铭言： : : 不好意思，请高手帮帮我 : : 1.就是我的目标基因 （insert，约400bp），接上T-A Vector， : : 送入E .coil中transform放大之後， : : 无法从T-A Vector 上切下来， : : 就无法把insert送去构筑在我所想构筑的另一个Vector上。 : : 我是这样做的： : : 有接inesrt（400bp）的T-A vector mini 取10λ : : ↓ : 你的DNA浓度呢? : 只取10ul的话,很可能它是有切下来的,只是切出来的band太淡了看不到 : 而且之後去ligation的话insert也需要多一点阿 : : 用Sma I 切（25度，4hr） total:30λ : : ↓ : : 做失活（80度，20min） : : 沈淀（total加到200λ，用phenol/chloroform，再用carrier+NaoAC+100%EtOH） : : 55度dry乾，溶ddH2O 23λ : : ↓ : : 用BanHI切/有添加BSA（37度，3hr） 23λ全下补到total:30λ : : ↓ : : 做失活（80度，20min） : : ↓ : : 跑gel 2λ (argarose，1%) : : 只出现一条>2000bp的band(因为我只用100bp maker) : : 并没有400bp的band : 确定你的enzyme buffer有用对吗? : 定序後切点的位置有突变吗? : : 注 : : T-A vector : 2728bp : : 我想请问： : : 1.为什麽我的insert切不下来？ : : 我用Sma I 、BanHI的时间都有加长 大约一倍了 : : 也做了失活 : : 需要的buffer不同，也有用phenol/chloroform啊 : : T-A vector上也确实有Sma I 、BanHI的切位 : : 我的inesrt也确定有接在T-A vector上（送过定序） : : 我该如何处理？该改进什麽地方？ : : 我在酵素的海报（我忘记哪间公司，好像是NETBIO） : : 对照时发现Sma I 、BanHI交叉点是「连续切位」 : : 请问这是什麽意思？ : : 会造成digestion失败吗？ : 意思就是这两种酵素的作用温度不同,buffer也不同,所以不能同时切 : 要切完一刀再切另一刀的意思 : 你做的方法就没错啦 : : 2.若之後顺利切下後 : : 构筑时（一端stick/一端blunt）又如何提高ligation成功率？ : : 该注意些什麽技巧？ : : 专题作不出来 : : 推徵眼看就要到 : : 恳请善心人士帮我一下 : : 感恩～～鞠躬～～～ 400bp跑完胶可能会太淡看不太到..再加上你经过phenol/chloroform纯化 一定会lost一些..所以建议你digest完直接跑胶.. 若要确定enzyme是否有作用可以分别做single digestion 跑完胶看size就知道是否有切动了. --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 163.25.91.19