作者tkmax (给你超强运~ :D)
看板Biotech
标题Re: [问题] western blotting
时间Sat Sep 23 23:48:01 2006
※ 引述《paua (waiting for good news)》之铭言：
: 我也有做P-Akt，但sample与你不同。
: 我说说我的步骤:
: 1. fresh cell lysate (收sample之後，马上定量、跑胶)
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
这步骤很重要,要看磷酸化蛋白
lysate一收下来就要快跑wetern了
不管有没有加phosphotase inhibitor
一进-80冰箱保存的话就都会degrade掉了~
: 2. 蛋白质定量後，40-50 ug/lane (小片胶)
: 3. transfer (semi dry) 15V (30-45min/1 mini gel, 45-60min/2 mini gels)
: 4. blocking buffer: 5%-milk-in-TBST, 1 hr at room temperature*
: 5. 1Ab (1:1000) in 5%-milk-in-TBST, 4 degree overnight
: 6. wash three times by TBST, 10 min each
: 7. 2Ab (1:1000) in 5%-milk-in-TBST, 1 hr at room temperature*
: 8. same as step 6
: 9. ECL 1 min
: 10.压片5-15分钟可见结果
: 以上* 注记与你实验中不同之处
: p.s. 我的milk的比例很随意，范围在3-5%
: ※ 编辑: paua 来自: 140.129.61.120 (09/23 02:14)
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■ν)
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