作者banlance (nona)
看板Biotech
标题Re: [问题] western blotting
时间Wed Sep 27 21:23:57 2006
我虽然没有做过P-AKT
不过我也曾经被搞的很惨
我那时候是做PP38
所以提供你一些方向
A>先确认sample有无问题
可以以actin测试现有的membrane来确认
B>上述OK的话
其实可以调一下1Ab，2Ab的条件例如温度时间浓度
虽然说明书有他的条件
可是SAMPLE来源不同其实还是要微调一下条件才能压出好片
若有任何问题欢迎大大指教
※ 引述《tkmax (给你超强运~ :D)》之铭言：
: ※ 引述《paua (waiting for good news)》之铭言：
: : 我也有做P-Akt，但sample与你不同。
: : 我说说我的步骤:
: : 1. fresh cell lysate (收sample之後，马上定量、跑胶)
: ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
: 这步骤很重要,要看磷酸化蛋白
: lysate一收下来就要快跑wetern了
: 不管有没有加phosphotase inhibitor
: 一进-80冰箱保存的话就都会degrade掉了~
: : 2. 蛋白质定量後，40-50 ug/lane (小片胶)
: : 3. transfer (semi dry) 15V (30-45min/1 mini gel, 45-60min/2 mini gels)
: : 4. blocking buffer: 5%-milk-in-TBST, 1 hr at room temperature*
: : 5. 1Ab (1:1000) in 5%-milk-in-TBST, 4 degree overnight
: : 6. wash three times by TBST, 10 min each
: : 7. 2Ab (1:1000) in 5%-milk-in-TBST, 1 hr at room temperature*
: : 8. same as step 6
: : 9. ECL 1 min
: : 10.压片5-15分钟可见结果
: : 以上* 注记与你实验中不同之处
: : p.s. 我的milk的比例很随意，范围在3-5%
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