作者aggaci (学钢琴，左手怎麽那麽笨)
看板Biotech
标题Re: [问题] RT PCR的问题
时间Thu Oct 5 21:25:12 2006
※ 引述《Mouseking (叫我老鼠王....-_-)》之铭言：
: ※ 引述《iris0542 (gg)》之铭言：
: : 我现在在做RT PCR
: : 不管我怎麽试internal control跑PCR後
: : 就是不一样多
: : 我绝得很奇怪 所以就拿了cDNA去测量
: 天啊，你的RT enzyme用很多吧，还可以拿去测OD?
我想这根enzyme用量无关
你拿cDNA去测浓度，差不多是很正常的
因为测的几乎都是free dNTP的在吸光
: : 发现量其实没有差很多
: : 所以我又拿了cDNA含量较近的几管去跑PCR
: : 结果GAPDH还是有的多 有的少 ~~
: : 还有有的基因根本就只有positive control做得出来
: : 其他的band都超弱
: : 想请问大家 我的问题出在哪里?
: : 是机器的温度不准吗 ?
: : 还是cDNA丢太多?(我用3ug去翻cDNA 3ug去pcr)
: 3ug是多了点....1ug错错有余，基本上我觉你的问题再rt....
: 建议你考虑1> Oligo dT还是random heximer?你要ｐｃｒ的基因其mRNA有枚特殊结构？
: 2> denature是否确实？建议反复一次在加入RT的材料...加材料也有顺序，
: 请教一下学长姐或老师
: 3> cDNA很不稳定，别一直反覆解冻，越多次越不准
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