※ 引述《Mouseking (叫我老鼠王....-_-)》之铭言： : ※ 引述《kate1114 (斑点兰献给迷迭香)》之铭言： : : 最近报告 常听到什麽''利用cDNA cloning 找出了一段miRNA...blablabla : : ..."" : : 但之前上课又学到说 cDNA clone技术的应用: : : 就是用由sample抽来的protein-->知此protein mRNA sequence-->再合成(还是反转录)cDNA : : (mature form) : (1)这一步是天方夜谭，听过wobble hypothesis吗？你这逻辑应该是理论吧！ 在以前，还是可以做作的啦，只是运气成份“超大“，首先 1.protein来源，做 N-ter sequencing，一般而言，有办法定出6个amino acid就够了。 2.有Wobble hypothesis的观念是正确的，所以人们也很天才的把所有的可能的forward primer都作出来，作什麽呢……RT-PCR，那reverse的primer要用什麽呢……oligo dT N-ter--------------------------C-ter ↓ ↓ 5'------/------------------------------/-----/--------3' ^^^^^^ ^^^^^ ^^^^^^^^ 5'-UTR 3'-UTR poly-A tail ↓ ↓ 理论cDNA:5'------------------------------/-----/----- 所以理论cDNA会含3'-UTR与一部份的poly-A tail 就到此为止而言，需要相当的运气…… 而後就是cloning的东西……，可以作到sequencing为止。 : : ----->再从genome比对--->可找出此protein可能有其他没被侦测的(pre-mature form) : (2)protein mature与否是由translational modification决定和genome sequence 无关喔！ 我想他指的是相同gene的产物，但是是不同的protein，例如：经过alternative splicing 的mature mRNA，是来自不同exon接起来的……(我自已想，应该是在RNA level) : : 我不知道我有没有会错老师的意思 不过依照我上课写的笔记 : : 要解释'利用cDNA cloning 找出了一段miRNA"真的很奇怪 > < : : 有大大知道如何解释咩~~ : : 要是我上面哪里写错了 也欢迎大家指正 : : 谢谢^^ : (3) 你这里的miRNA用的有点怪（miRNA的来源和定义见下文），目前cDNA的制备多采用 : RT-PCR的方式，很少有人是从protein下手，因为目前protein序列分析技术没有核酸序 : 列分析来的方便；miRNA也绝对不是从cDNA cloning找的到的！ : In genetics, microRNAs (miRNA) are single-stranded RNA molecules of about 21-23 : nucleotides in length thought to regulate the expression of other genes. : miRNAs are encoded by RNA genes that are transcribed from RNA but not trans- : lated into protein; instead they are processed from primary transcripts known : as pri-miRNA to short stem-loop structures called pre-miRNA and finally to : functional miRNA. Mature miRNA molecules are complementary to regions in one : or more messenger RNA (mRNA) molecules, which they target for degradation 这个我认为是找siRNA才会用到的方法，由於miRNA往往是自然存在於生物体中，从 genomic DNA transcript而来，所以我个人较偏向是设计siRNA时所采用的方法。 --

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