作者circleming (新世纪音乐)
看板Biotech
标题[问题] cloning
时间Wed Nov 1 10:42:07 2006
想请教各位一些经验，
最近学姐叫我做一个cloning..
而她希望得到high fidelity...因此我们使用PFU进行PCR...
试了一些条件，
跑胶的结果得到大小类似的band...
但确定有东西，但是估计浓度不高，
因此如果说跑胶切胶再纯化，
大概就回收不了太多DNA，
因此改变策略，
先将cDNA用较不理想的primer约略取到我们要的部分，
然後再用比较理想的primer进一步target...
之所以不直接用後者是因为直接用的结果无产物（有点奇怪）
好，现在二次PCR後跑胶，
同样根据size..估计应为我们要的东西，
但是因为担心进一步纯化PCR会大量流失DNA，
因此PCR产物未进行纯化，
而直接转到vector(使用TOPO vector: pcDNA3.1D/V5-His-TOPO)
然後transform...利用Amp筛选～
得到的菌落进行mini-prep...
然後测sequence...
但是却很扯，
因为～六个sample...
得到的sequence类似～
我可以顺利找到我的primer sequence...
但是却找不到我要的target sequence...
因为完全不知道我拿到的sequence是啥，
所以上NCBI blast...
结果出来的结果居然是vector...@@
如果说transform进去的是空的vector也就算了～
那我之前PCR出来弱弱的band跑到哪里去了...-_-"
问了两个实验室，他们都说很诡异～
想请问大家知不知道为什麽会这样～
到底我哪一步出错了....> <
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 12.206.233.228
1F：推 ROKEE:我会建议用PFU+比较好的primer 多做几次 11/01 12:51
2F：→ ROKEE:把总量先提高,然後PCR产物先浓缩再去跑胶回收... 11/01 12:51
3F：推 chiehgriffin:PCR cycle可以多一些，并且使用pfu，基因多大呢？ 11/01 15:42
4F：推 blence:pfu product拿去接TOPO，这样要看到空的vector很容易 11/01 16:28
5F：推 ROKEE:不建议PCR cycle拉高,容易出错,我要接clone都只跑20个cycle 11/01 16:33
6F：推 circleming:901 bp.这会影响吗？ 11/01 20:22